受试者招募与样本采集
获取健康供者外周血样本用于免疫细胞分离和后续分析
从91名健康志愿者采集白细胞分离样本，分离PBMC并冻存。
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遗传多态性对人免疫细胞基因表达的影响
Impact of Genetic Polymorphisms on Human Immune Cell Gene Expression.
实验完整度
高多细胞类型转录组与eQTL分析、功能验证（siRNA敲低、FACS）及多个独立证据层级。
主要模型
91名健康受试者外周血单核细胞（PBMC） 13种原代免疫细胞类型（含单核细胞、NK细胞、B细胞、CD4+ T细胞亚群等） 活化后的naïve CD4+和CD8+ T细胞
重点核对
受试者样本：91名健康受试者（54名男性，37名女性），中位年龄27岁 免疫细胞分选方案：四色FACS panel，分选门控策略见Fig. S1A–D eQTL分析阈值：FDR < 0.05，原始P值 < 0.0001，TPM > 1.0 siRNA敲低效率：转染后48小时通过实时PCR检测 活化条件：naïve CD4+/CD8+ T细胞使用Dynabeads CD3/CD28按1:1比例活化4小时
摘要
虽然许多遗传变异已被认为与人类疾病风险相关，但这些变异如何影响各种细胞类型中的基因表达仍 largely 未知。为填补这一空白，建立了DICE（免疫细胞表达、表达数量性状位点（eQTLs）和表观基因组学数据库）项目。考虑所有研究的人免疫细胞类型和条件，我们共鉴定出12,254个独特基因的顺式eQTLs，占这些细胞类型中表达的所有蛋白质编码基因的61%。引人注目的是，这些基因中很大一部分（41%）仅在单一细胞类型中显示出与基因型的强顺式关联。我们还发现，生物学性别以高度细胞特异性的方式与免疫细胞基因表达的主要差异相关。这些数据集将有助于揭示疾病风险相关遗传多态性对特定免疫细胞类型的影响，为它们如何影响发病机制提供机制见解（http://dice-database.org）。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 遗传变异如何影响不同人免疫细胞类型中的基因表达，以及这些变异与疾病风险的关联？
- 核心机制
- 顺式eQTLs以细胞类型特异性方式调控基因表达，部分eQTLs仅在特定细胞类型或活化条件下显现；生物学性别也以细胞特异性方式影响免疫细胞基因表达。
- 主要证据
- 对91名健康受试者的13种免疫细胞类型和2种活化条件进行RNA-seq和基因分型，鉴定出12,254个基因的cis-eQTLs；通过siRNA敲低（GAB2、LACC1、NAB1、SYNGR1、FAM13A）和FACS验证功能。
- 研究意义
- 提供人类免疫系统转录组和eQTL参考图谱，有助于将疾病风险变异与特定免疫细胞类型和分子通路联系起来，并促进对性别差异免疫反应的理解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
免疫细胞分选
分离高纯度免疫细胞类型用于转录组和eQTL分析
使用荧光标记抗体和FACS分选13种免疫细胞类型，部分细胞经磁珠预富集。
RNA测序
获取各免疫细胞类型的转录组数据
提取总RNA，构建链特异性mRNA文库，在Illumina HiSeq 2500平台测序。
基因分型与imputation
获取受试者基因型数据用于eQTL分析
从PBMC提取DNA，使用Infinium Multi-Ethnic Global-8 Kit进行基因分型，并基于1000 Genomes Project进行imputation。
eQTL分析
鉴定与基因表达相关的遗传变异（cis-eQTLs）
使用Matrix eQTL软件将SNP与基因表达关联，校正协变量，确定显著性阈值。
功能验证（siRNA敲低）
验证eQTL相关基因在免疫细胞中的功能
对GAB2、LACC1、NAB1、SYNGR1、FAM13A等基因进行siRNA敲低，检测细胞活化标志物和细胞因子表达。
性别差异表达分析
鉴定性别偏向表达的转录本
使用DESeq2比较女性和男性受试者间的基因表达差异，校正祖先和年龄。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分选 | 人B细胞分离试剂盒II | Miltenyi Biotec | 130-091-151 |
| 记忆CD4+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-091-893 | |
| 初始CD4+ T细胞分离试剂盒II | Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| NK细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-092-657 | |
| CD4+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-533 | |
| RNA提取 | miRNeasy Micro试剂盒 | Qiagen | -- |
| TRIzol | Invitrogen | -- | |
| RNA质控 | 高灵敏度RNA ScreenTape试剂盒 | Agilent Life Sciences | -- |
| 文库构建 | TruSeq链特异性mRNA HT样本制备试剂盒 | Illumina | -- |
| 测序 | HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- |
| HiSeq SBS试剂盒v4 | Illumina | -- | |
| DNA提取 | DNeasy血液与组织试剂盒 | Qiagen | -- |
| 基因分型 | Infinium多民族全球-8试剂盒 | Illumina | -- |
| 细胞培养 | IMDM培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 人AB血清 | CellGro | -- | |
| T细胞活化 | Dynabeads人T细胞活化剂CD3/CD28 | ThermoFisher Scientific | -- |
| siRNA敲低 | ON-TARGETplus SMARTpools | Dharmacon | -- |
| Neon转染系统 | Invitrogen | -- | |
| 实时PCR | SuperScript III第一链合成系统 | Life Technologies | -- |
| Fast Start通用SYBR Green预混液 | Roche | -- | |
| QuantStudio 6 Flex实时PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| NK细胞刺激 | 人IgG | -- | -- |
| 细胞因子检测 | U-PLEX检测试剂盒 | Meso Scale Discovery | -- |
| 流式细胞术 | BD FACSAria II流式细胞分选仪 | Becton Dickinson | -- |
| BD FACSAria Fusion流式细胞分选仪 | Becton Dickinson | -- | |
| 细胞培养 | 佛波酯 | -- | -- |
| 离子霉素 | -- | -- | |
| 布雷菲德菌素A | Sigma-Aldrich | -- | |
| IL-7 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 细胞刺激 | Pam3CSK4 | Invivogen | -- |
| 抗原特异性T细胞刺激 | PepTivator hCMV pp65 | Miltenyi Biotec | -- |
| 流式细胞术 | CellTrace Violet | ThermoFisher Scientific | -- |
| 抗CD40抗体 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 细胞培养 | 抗CD3抗体 | -- | -- |
| 抗CD28抗体 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 受试者与样本 | 受试者数量、性别比例、年龄范围、健康状态及样本来源 阅读提示：STAR Methods中“EXPERIMENTAL MODEL AND SUBJECT DETAILS”及Table S1A |
| 免疫细胞分选 | 分选panel、门控策略、预富集试剂盒及分选平台 阅读提示：STAR Methods中“Sample processing”及Fig. S1A–D、Table S6A |
| RNA测序 | RNA提取试剂盒、文库构建试剂盒、测序平台及读长 阅读提示：STAR Methods中“RNA sequencing” |
| 基因分型与imputation | 基因分型芯片、imputation软件及参考面板 阅读提示：STAR Methods中“Genotyping, imputation and determination of Eqtl” |
| eQTL分析 | 分析窗口、显著性阈值、协变量及过滤标准 阅读提示：STAR Methods中“Genotyping, imputation and determination of Eqtl” |
| siRNA敲低功能验证 | siRNA浓度、转染参数、敲低效率检测时间及刺激条件 阅读提示：STAR Methods中“Validation of gene function in primary immune cells” |
| 性别差异表达分析 | 女性与男性受试者数量、协变量及显著性阈值 阅读提示：STAR Methods中“RNA-Seq analysis”及“QUANTIFICATION AND STATISTICAL ANALYSIS” |