葡萄糖来源乙酸生成的示踪检测
验证葡萄糖/丙酮酸能否在哺乳动物细胞中定量生成乙酸。
HCT116等细胞在[13C6]-葡萄糖培养基中培养，经HQ衍生化后LC-HRMS检测[13C2]-乙酸、[13C3]-丙酮酸和[13C3]-乳酸动力学。
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哺乳动物中葡萄糖生成乙酸及其与线粒体代谢的偶联
Acetate Production from Glucose and Coupling to Mitochondrial Metabolism in Mammals.
实验完整度
高包含多种细胞系体外实验、纯化酶体外实验、CRISPR敲除、18O2示踪、小鼠肿瘤模型体内示踪及共培养功能验证。
主要模型
人结直肠癌HCT116细胞 SKOV3等癌细胞系 ACLY敲除小鼠胚胎成纤维细胞 小鼠软组织肉瘤模型
重点核对
[13C6]-葡萄糖示踪检测HCT116细胞中[13C2]-乙酸生成 18O2示踪检测ROS介导的[18O1]-乙酸生成 纯化PDH/aKGDH体外反应及辅因子TPP、CoA、NAD+对产物影响 PDH敲除及硫胺素剥夺对乙酸生成的影响 小鼠体内[13C6]-葡萄糖输注后肿瘤组织13C标记乙酸检测
摘要
乙酸是支持乙酰辅酶A（Ac-CoA）代谢进而支持脂肪生成和蛋白乙酰化的主要营养素，但其来源尚不清楚。本文报道，丙酮酸作为糖酵解的终产物和中心碳代谢的关键节点，在哺乳动物中定量生成乙酸。这种现象在营养过剩如糖代谢过度活跃时更为明显。丙酮酸转化为乙酸通过两种机制发生：1）与活性氧（ROS）偶联；2）酮酸脱氢酶的拟态酶活性使其发挥丙酮酸脱羧酶功能。进一步证明，在代谢受限环境如线粒体功能障碍或ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）缺陷时，从头乙酸生成维持Ac-CoA池和细胞增殖。从头乙酸生成在哺乳动物中发生并进一步与线粒体代谢偶联，提供了可能的调控机制及与病理生理学的联系。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哺乳动物中乙酸是否可由葡萄糖/丙酮酸从头合成，其反应机制及生物学功能为何。
- 核心机制
- 丙酮酸通过ROS介导的氧化脱羧和硫胺素依赖的酮酸脱氢酶（PDH、aKGDH）拟态丙酮酸脱羧酶活性两条机制生成乙酸。
- 主要证据
- 13C/18O同位素示踪、纯化酶体外实验、PDH敲除和硫胺素剥夺细胞、小鼠肿瘤13C-葡萄糖输注及ACLY缺陷细胞共培养功能验证。
- 研究意义
- 揭示了哺乳动物中心碳代谢中丙酮酸来源的溢出途径，从头乙酸生成可维持乙酰辅酶A池和细胞增殖，并与线粒体代谢及病理生理学相关联。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
排除乙酰辅酶A相关反应来源
验证乙酸生成是否独立于Ac-CoA水解和组蛋白脱乙酰化。
比较Ac-CoA浓度，SAHA处理检测组蛋白乙酰化及[13C2]-乙酸释放速率，UK5099处理检测Ac-CoA、Ac-carnitine、柠檬酸和乙酸。
ROS介导丙酮酸脱羧的18O2示踪
验证内源性H2O2是否介导丙酮酸氧化脱羧生成乙酸。
细胞在18O2气氛下培养，LC-HRMS检测[18O1]-乙酸，并用TTM抑制SOD、外源[18O2]-H2O2处理。
酮酸脱氢酶拟态活性验证
验证PDH和aKGDH在辅因子缺乏时可将丙酮酸转化为乙酸和乙醛。
纯化猪心PDH或aKGDH与[13C3]-丙酮酸孵育，检测乙酸、乙醛、Ac-CoA和Ac-GSH生成；细胞中PDH敲除、硫胺素剥夺和CPI-613处理。
体内乙酸生成验证
验证小鼠体内肿瘤组织可由葡萄糖生成乙酸。
荷瘤小鼠持续输注[13C6]-葡萄糖3小时，检测肿瘤和血清中13C标记丙酮酸、乳酸、乙酸和乙醛。
乙酸支持乙酰辅酶A池的功能验证
验证从头生成乙酸可支持ACLY缺陷细胞的增殖和脂肪生成。
ACLY敲除MEF与HCT116细胞Transwell共培养，检测培养基乙酸浓度、细胞增殖和[13C6]-葡萄糖掺入棕榈酸。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Cellgro | 11875-093 |
| 无葡萄糖RPMI 1640培养基 | ThermoFisher Scientific | 11879020 | |
| 透析胎牛血清 | ThermoFisher Scientific | H00000406-P01 | |
| 同位素示踪 | [13C6]-D-葡萄糖 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396-1 |
| 3,3,3-[2H3]-乳酸钠 | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-9071-0.1 | |
| 18O2气体 | Sigma-Aldrich | 490474-1L | |
| [18O2]-过氧化氢 | Sigma-Aldrich | 609978 | |
| 药物处理 | SAHA | Sigma-Aldrich | SML0061 |
| 四硫代钼酸铵 | Sigma-Aldrich | 323446 | |
| CPI-613 | Sigma-Aldrich | SML0404 | |
| UK5099 | Sigma-Aldrich | PZ0160 | |
| 体外酶反应 | 猪心α-酮戊二酸脱氢酶 | Sigma-Aldrich | K1502-20UN |
| 辅酶A钠盐水合物 | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
| Western blot | 兔多克隆抗ATP柠檬酸裂解酶抗体 | Proteintech | 15421-1-AP |
| 兔多克隆抗α-酮戊二酸脱氢酶抗体 | Cell Signaling Technology | 26865S | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | 13778030 |
| 亚细胞分离 | 培养细胞线粒体分离试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 89874 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 葡萄糖来源乙酸示踪 | [13C6]-葡萄糖浓度11.1 mM；培养基为RPMI 1640含10%透析FBS；取样时间点0-40 min；n=3 阅读提示：STAR Methods细胞培养小节及Figure 1图注 |
| 18O2示踪 | 气相为20% O2（18O2/16O2）和80% N2；TTM 25 μM或UK5099 5 μM；处理15-60小时；HEPES缓冲无NaHCO3培养基 阅读提示：STAR Methods 18O2 tracing assay小节及Figure 2图注 |
| 纯化酮酸脱氢酶反应 | [13C3]-丙酮酸200 μM；TPP 5 μM；NAD+ 0.5 mM；GSH 4 mM；CoA 0.01/0.1/0.4 mM；37 °C反应30 min 阅读提示：STAR Methods Purified keto acid dehydrogenase assay小节及Figure 3图注 |
| 小鼠体内13C-葡萄糖输注 | 输注速率20 mg/kg/min；输注3小时；禁食6小时；8-10周龄C57BL/6J及肉瘤模型小鼠；n=5 阅读提示：STAR Methods Animal小节及Figure 4H-4L图注 |
| ACLY KO共培养 | Transwell孔径0.4 μm；MEF接种25000/孔，HCT116接种50000/insert；共培养30或72小时；10%透析FBS 阅读提示：STAR Methods Co-culture assay小节及Figure 5图注 |