CBP/p300乙酰化组图谱构建
鉴定CBP/p300在体内调控的乙酰化位点并验证抑制剂特异性
用条件性基因敲除、催化抑制剂Cmpd-R和A-485、溴结构域抑制剂CBP112处理MEF细胞，SILAC定量质谱检测乙酰化位点及蛋白丰度变化
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时间分辨分析揭示CBP/p300乙酰化组的快速动态与广泛范围
Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome.
实验完整度
高包含MEF与Kasumi-1细胞乙酰化组、体外p300乙酰化、293FT过表达、转录组与蛋白组及时间分辨动力学等多层级验证
主要模型
Crebbpfl/fl;Ep300fl/fl小鼠胚胎成纤维细胞(MEF) 人急性髓系白血病细胞系Kasumi-1 人胚肾293FT细胞 PC-3细胞
重点核对
A-485处理时间点：10、20、30、60、120、240、480分钟 催化抑制剂浓度：Cmpd-R和A-485均为3μM，处理16小时；CBP112为5μM，处理16小时 基因敲除：2μM 4-OHT每12小时处理一次共四次，48小时内完成，再培养24–36小时 FICZ浓度10μM诱导Cyp1a1，Cmpd-R在FICZ后1小时加入 乙酰化组、蛋白组和转录组均为生物学三重复（部分体外实验为二重复）
摘要
乙酰转移酶CBP和p300是多功能转录共激活因子。本研究将定量蛋白质组学与CBP/p300特异性催化抑制剂、溴结构域抑制剂及基因敲除相结合，绘制了受调控乙酰化位点及其动态周转率的综合图谱。CBP/p300可乙酰化数千个位点，包括标志性组蛋白位点，以及大量信号效应因子和增强子相关转录调控因子上的位点。时间分辨乙酰化组分析鉴定出一部分CBP/p300调控位点具有非常迅速（<30分钟）的乙酰化周转，揭示乙酰化与去乙酰化之间的动态平衡。对CBP/p300抑制后乙酰化、mRNA和蛋白丰度的定量分析，揭示了一个动力学上相匹配的基因表达网络，该网络严格依赖CBP/p300催化的快速乙酰化。总体而言，本研究的深入乙酰化组分析揭示了CBP/p300靶点的系统特征，该资源数据集为研究CBP/p300功能以及理解靶向其催化和溴结构域活性的小分子抑制剂的影响提供了框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 系统鉴定CBP/p300在体内的乙酰化底物、位点特异性乙酰化动力学，以及CBP/p300催化、溴结构域和支架功能在转录与蛋白表达调控中的作用。
- 核心机制
- CBP/p300催化活性是其调控乙酰化及基因转录的主要机制；快速周转的CBP/p300催化乙酰化位点驱动基因转录，去乙酰化主要由赖氨酸去乙酰化酶(KDAC)介导。
- 主要证据
- SILAC定量质谱在KO、Cmpd-R、A-485和CBP112处理后量化约21,000个乙酰化位点；时间分辨分析显示619个位点中位去乙酰化半衰期94分钟，部分<30分钟；Cmpd-R在FICZ后1小时加入几乎立即阻断Cyp1a1转录。
- 研究意义
- 提供了研究CBP/p300功能及理解靶向其催化和溴结构域活性小分子抑制剂影响的资源框架，并提示H2B N端乙酰化等标志物及快速乙酰化位点在转录调控中的重要性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CBP/p300乙酰化组保守性与特异性验证
验证CBP/p300靶点在人和小鼠细胞中的保守性及细胞环境对特异性的贡献
在Cmpd-R处理的Kasumi-1细胞中定量乙酰化组；用重组p300进行体外乙酰化及在293FT细胞中过表达p300，比较与KO细胞的乙酰化变化
乙酰化位点时间分辨动力学分析
获得全蛋白质组规模的位点特异性乙酰化周转率
A-485处理后多个时间点SILAC定量质谱，模糊c-means聚类并计算去乙酰化半衰期
组蛋白乙酰化图谱分析
系统绘制CBP/p300调控的组蛋白乙酰化位点及动力学
整合不同组蛋白异构体同位点数据，计算中位乙酰化比值、强度和去乙酰化半衰期，并用重组H3K56ac spike-in和位点特异性抗体验证
转录组与蛋白组分析及Cyp1a1功能验证
解析CBP/p300催化活性对基因表达和蛋白丰度的影响及急性转录调控
在KO、Cmpd-R、A-485和CBP112处理后测量转录组和蛋白组；用FICZ诱导Cyp1a1并用qPCR检测Cmpd-R加入后的转录变化
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与处理 | 4-羟基他莫昔芬 | Sigma | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Biowest | -- |
| RPMI1640培养基 | Biowest | -- | |
| SILAC标记 | 13C6,15N4-精氨酸 | Sigma | -- |
| 13C6,15N2-赖氨酸 | Cambridge Isotope Laboratories | -- | |
| 细胞裂解 | 完全蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| 蛋白定量 | BCA实验 | Pierce | -- |
| 肽段纯化 | Sep-pak C18柱 | Waters | -- |
| 乙酰化肽段富集 | PTMscan乙酰赖氨酸抗体试剂盒 | Cell Signaling Technologies | -- |
| 体外乙酰转移酶实验 | 生物素化组蛋白H4(1–23)合成肽 | Anaspec | AS-65097 |
| 乙酰辅酶A | Sigma-Aldrich | A2056 | |
| TR-FRET检测 | LANCE Ultra铕标记抗乙酰化组蛋白H4赖氨酸抗体 | Perkin Elmer | TRF0412-D |
| LANCE Ultra ULight-链霉亲和素 | Perkin Elmer | TRF0102-D | |
| LANCE检测缓冲液 | PerkinElmer | CR97-100 | |
| 白色384孔低体积板 | Perkin Elmer | 6008289 | |
| 高内涵显微成像 | I型胶原包被96孔观察板 | Perkin Elmer | 6005810 |
| 10%甲醛 | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| H3K9ac抗体 | Cell Signaling Technology | 9649 | |
| H3K27ac抗体 | Cell Signaling Technology | 8173 | |
| Alexa Fluor488标记山羊抗兔IgG | Life Technologies | A-11029 | |
| Alexa Fluor555标记山羊抗小鼠IgG | Life Technologies | A-21424 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| 质谱分析 | Q-Exactive HF质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| 转录组分析 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| 2100 Bioanalyzer系统 | Agilent Technologies | -- | |
| 小鼠基因表达微阵列(8 × 60K) | Agilent Technologies | G4852B | |
| 低输入快速扩增标记试剂盒 | Agilent Technologies | 5190-2305 | |
| qPCR | QuantiTect逆转录试剂盒 | Qiagen | -- |
| Brilliant II SYBR Green QPCR预混液 | Agilent | -- | |
| Stratagene Mx3005P仪器 | Stratagene | -- | |
| Western blot | H2BK5ac抗体 | Cell Signaling Technology | 12799 |
| H2BK15ac抗体 | Cell Signaling Technology | 9083 | |
| H2B抗体 | Cell Signaling Technology | 8135 | |
| H3K18ac抗体 | Cell Signaling Technology | 13998 | |
| H3抗体 | Cell Signaling Technology | 4499 | |
| H3K122ac抗体 | Abcam | ab33309 | |
| H3K56ac抗体 | Abcam | ab76307 | |
| H2BK120ac抗体 | Upstate | 07-564 | |
| 293FT细胞转染 | Turbofect转染试剂 | Thermo Scientific | R0531 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因敲除处理 | 4-OHT浓度2μM、每12小时一次共四次、48小时处理及再培养24–36小时 阅读提示：Star Methods中Cell culture and sample preparation小节 |
| 催化抑制剂处理 | Cmpd-R和A-485均为3μM处理16小时；CBP112为5μM处理16小时 阅读提示：Star Methods中Cell culture and sample preparation小节及Figure 1图注 |
| 乙酰化组定量质谱 | SILAC标记、PTMscan乙酰赖氨酸抗体富集、生物学三重复 阅读提示：Star Methods中Cell culture and sample preparation及Mass spectrometry小节，Table S2和S3 |
| 时间分辨动力学 | A-485处理时间点10、20、30、60、120、240、480分钟及每时间点重复数 阅读提示：Table S3及Figure 4图注 |
| 体外p300乙酰化实验 | 40nM p300、20μM acetyl-CoA、30°C 30分钟，±20μM A-485预孵育 阅读提示：Star Methods中Cell lysate protein acetylation及Recombinant protein acetylation in vitro小节 |
| Cyp1a1转录诱导实验 | FICZ浓度10μM、Cmpd-R在FICZ后1小时加入、检测2小时和3小时时间点 阅读提示：Star Methods中Quantitative PCR analysis of Cyp1a1 gene expression小节及Figure 6F和6G图注 |
| 转录组分析 | 生物学三重复、微阵列平台G4852B及SAM分析阈值 阅读提示：Star Methods中Analysis of transcript abundance及Statistical analysis of microarray data小节 |