化学筛选与LCDM条件建立
寻找支持人naive多能性及不依赖TGF-β自我更新的小分子组合
以OCT4远端增强子报告基因在H9细胞中筛选化合物库，再筛选支持穹顶状集落及TGF-β抑制剂SB 431542条件下自我更新的候选，组合优化得到LCDM
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具有体内胚胎和胚外发育潜能的多能干细胞的建立
Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency.
实验完整度
高含人与小鼠多能干细胞体外培养、单细胞胚胎注射嵌合、四倍体补偿、转录组与ChIP-seq及Parp1敲除机制验证
主要模型
人始发态多能干细胞（H1、H9、0227E、HSF1、HSF6） 人EPS细胞（由始发态多能干细胞转化、囊胚建立或体细胞重编程获得） 小鼠EPS细胞（由囊胚建立或由小鼠ES细胞转化） 8细胞期小鼠胚胎及E10.5–E17.5孕体嵌合模型
重点核对
芯片法培养：人用CHIR 99021 1 μM、小鼠用3 μM，DiM 2 μM，MiH 2 μM，hLIF 10 ng/ml 单细胞注射8细胞期胚胎后培养48–60 hr，检测ICM与TE共贡献 四倍体补偿：单个mEPS细胞注入四倍体囊胚，统计产仔数 多细胞嵌合：E2.5或E3.5胚胎注射10–15个细胞，E12.5等阶段检测Em与E×Em贡献 RNA-seq与H3K4me3/H3K27me3 ChIP-seq比较EPS与已知PSC
摘要
在已知所有培养的干细胞类型中，多能干细胞（PSCs）处于发育潜能图谱的顶端，其特征是能够产生成体生物的所有细胞类型。然而，PSCs 在体内对胚外胎盘组织的贡献有限。在此，我们展示一种化学混合物能够从小鼠和人类中建立具有独特功能和分子特征的干细胞，命名为扩展多能干细胞（EPS 细胞），其能够嵌合胚胎和胚外组织。值得注意的是，单个小鼠 EPS 细胞在体内对胚胎和胚外谱系均表现出广泛的嵌合贡献，并允许通过四倍体补偿产生单 EPS 细胞来源的小鼠。此外，人类 EPS 细胞在小鼠孕体中表现出种间嵌合能力。我们的发现构成了在培养中捕获具有胚外发育潜能的多能干细胞的第一步，并为基础和转化研究开辟了新途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否在体外建立并稳定维持具有胚胎与胚外双向发育潜能的哺乳动物多能干细胞？
- 核心机制
- LCDM化学混合物（hLIF、CHIR 99021、DiM、MiH）通过抑制PARP1及组胺和毒蕈碱受体信号维持EPS细胞的发育潜能，Parp1是维持该潜能的重要调控因子。
- 主要证据
- LCDM可从人和小鼠囊胚建立及由PSCs转化EPS细胞；单个mEPS细胞在8细胞期胚胎中同时贡献ICM和TE，可经四倍体补偿产生完整个体（7/311）；单个人EPS细胞可在小鼠囊胚及E10.5孕体中形成种间嵌合。
- 研究意义
- 为理解初始细胞命运决定提供细胞工具，并可能用于构建研究胎盘、卵黄囊和胚胎发育的新动物模型；作者还提出其在体内疾病建模、药物发现和组织生成方面的潜在用途。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
人EPS细胞的建立与表征
验证LCDM能否转化、从头建立及重编程获得人EPS细胞
将始发态hPSCs转化、人囊胚直接建立及体细胞重编程获得hEPS细胞，检测多能性标志、三胚层分化、OCT4-DE活性、H3K27me3、核型与基因组稳定性
小鼠EPS细胞的建立与多细胞嵌合验证
检验LCDM来源小鼠干细胞是否获得胚外发育潜能
从囊胚建立或由mES细胞转化mEPS，注射多细胞至E2.5/E3.5胚胎，E12.5检测Em与E×Em贡献
单细胞水平发育潜能验证
以最严格方式证明单个mEPS细胞同时贡献ICM和TE
单个Tdtomato标记mEPS细胞注入8细胞期胚胎，培养48–60 hr后免疫染色检测CDX2/GATA3与OCT4/NANOG共表达；并从同一嵌合囊胚分别建立ES和TS细胞
体内胚外谱系贡献与功能验证
评估单mEPS细胞来源细胞在胚胎、胎盘和卵黄囊中的整合及滋养层功能
分析E10.5、E12.5、E17.5孕体，FACS检测贡献比例，免疫染色CK8、PROLIFERIN、TPBPA，Transwell侵袭实验及滋养层标志基因qPCR、倍体分析
出生后嵌合与四倍体补偿
验证单mEPS细胞的种系传递与完整多能性
统计单mEPS细胞来源嵌合小鼠出生率与种系传递，并将单个mEPS细胞注入四倍体囊胚产生四倍体补偿小鼠
人EPS细胞种间嵌合验证
检验人EPS细胞能否在小鼠胚胎中形成种间嵌合
单个荧光标记hEPS细胞注入8细胞期小鼠胚胎，48–60 hr检测ICM/TE共贡献；E10.5孕体以抗人核抗体、荧光蛋白及线粒体PCR检测人细胞贡献
分子特征与机制解析
阐明EPS细胞的转录组、表观遗传特征及DiM/MiH的作用靶点
RNA-seq与PCA比较EPS与已知PSC及着床前胚胎细胞，ChIP-seq分析H3K4me3/H3K27me3，DiM/MiH撤除与替代实验，Parp1敲除mEPS细胞
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 重组人白血病抑制因子 | Peprotech | 300-05 |
| CHIR 99021 | Tocris | 4423 | |
| (S)-(+)-马来酸二甲茚定 | Tocris | 1425 | |
| 盐酸米诺环素 | Santa Cruz Biotechnology | sc-203339 | |
| IWR-1-endo | Selleckchem | S7086 | |
| PD 0325901 | Tocris | 4192 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| 毛喉素 | Tocris | 1099 | |
| 敲除血清替代物 | Thermo Fisher Scientific | A3181502 | |
| ES筛选胎牛血清 | Hyclone | SH30070.03E | |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30396.03HI | |
| Neurobasal培养基 | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | |
| DMEM/F-12培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| N-2添加剂 | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| B-27添加剂（不含维生素A） | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| GlutaMAX添加剂 | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| 非必需氨基酸溶液 | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A1470 | |
| 细胞传代 | 胰蛋白酶-EDTA（0.05%，含酚红） | Thermo Fisher Scientific | 25300-062 |
| Accutase细胞消化液 | Millipore | SCR005 | |
| Dispase II粉末 | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| 细胞培养 | Matrigel基质胶 | Corning | 354248 |
| 高糖DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
| IMDM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 12440-053 | |
| 敲除DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 10829-018 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Corning | 21-040-CVR | |
| 人囊胚建立EPS细胞 | 灰色链霉菌蛋白酶 | Sigma-Aldrich | P8811 |
| G-2 PLUS培养基 | Vitrolife | 10132 | |
| 胚胎培养 | EmbryoMax KSOM胚胎培养基 | Millipore | MR-020P-5F |
| 胚胎操作 | EmbryoMax M2培养基 | Millipore | MR-015-D |
| 矿物油 | Sigma-Aldrich | M8691 | |
| 胚胎显微注射 | XY Clone激光 | Hamilton Thorne, Inc. | -- |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
| 正常驴血清 | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| DAPI | Roche Life Science | 10236276001 | |
| 胎盘组织消化 | IV型胶原酶粉末 | Thermo Fisher Scientific | 17104019 |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Sigma-Aldrich | T9424 |
| RT-qPCR | KAPA SYBR FAST通用2×qPCR预混液 | KAPA Biosystems | KK4601 |
| Power SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | 4367659 | |
| TransScript第一链cDNA合成预混液 | Transgen Biotech | AT301 | |
| 基因组PCR | 2×EasyTaq PCR预混液 | Transgen Biotech | AS111 |
| DNA提取 | DNeasy血液与组织试剂盒 | QIAGEN | 69506 |
| RNA提取 | RNeasy迷你试剂盒 | QIAGEN | 74106 |
| 荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1960 |
| 4D-Nucleofector系统 | Lonza | AAF-1002B; AAF-1002X; AAF-1002Y | |
| P3原代细胞4D-Nucleofector试剂盒L | Lonza | V4XP-3024 | |
| RNA-seq建库 | NEBNext Ultra RNA文库构建试剂盒（Illumina） | NEB England BioLabs | E7530L |
| ChIP-seq建库 | NEBNext Ultra DNA文库构建试剂盒（Illumina） | NEB England BioLabs | E7370S |
| ChIP | 磁珠Protein-G | -- | -- |
| 蛋白酶K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Technology | P0013B |
| Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂单次使用混合物（无EDTA） | Thermo Fisher Scientific | 78443 | |
| Halt磷酸酶抑制剂单次使用混合物 | Thermo Fisher Scientific | 78428 | |
| Immobilon-P PVDF膜（0.45 μm） | Millipore | IPVH07850 | |
| NuPAGE Novex 10% Bis-Tris凝胶 | Thermo Fisher Scientific | NP0315BOX | |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris凝胶 | Thermo Fisher Scientific | NP0341PK2 | |
| NuPAGE转膜缓冲液（20×） | Thermo Fisher Scientific | NP0006 | |
| NuPAGE MOPS SDS电泳缓冲液（仅用于Bis-Tris凝胶，20×，500 ml） | Thermo Fisher Scientific | NP0001 | |
| BeyoECL Star | Beyotime Technology | P0018A | |
| Transwell侵袭实验 | BioCoat Matrigel侵袭小室（8.0 μm PET膜，两个24孔板，12/包，24/箱） | Corning | 354480 |
| Western blot | 抗细胞角蛋白8（M20） | Santa Cruz Biotechnology | sc-52324; RRID:AB_629847 |
| 抗增殖蛋白（C-14） | Santa Cruz Biotechnology | sc-47345; RRID:AB_785326 | |
| 免疫荧光 | 抗GATA4（C-20） | Santa Cruz Biotechnology | sc-1237; RRID:AB_2108747 |
| 抗Sox-2（Y-17） | Santa Cruz Biotechnology | sc-17320; RRID:AB_2286684 | |
| 抗Oct-3/4（C-10） | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279; RRID:AB_628051 | |
| 抗GKLF（H-180） | Santa Cruz Biotechnology | sc-20691; RRID:AB_669567 | |
| 抗LHX5（KP-02） | Santa Cruz Biotechnology | sc-130469; RRID:AB_2135825 | |
| 抗β3微管蛋白（AA10） | Santa Cruz Biotechnology | sc-80016; RRID:AB_2210523 | |
| Western blot | 抗PARP-1/2（H-250） | Santa Cruz Biotechnology | sc-7150; RRID:AB_2160738 |
| 免疫荧光 | 抗GATA3（HG3-31） | Santa Cruz Biotechnology | sc-268; RRID: AB_2108591 |
| 抗滋养层特异性蛋白α | Abcam | ab104401; RRID:AB_10901888 | |
| 抗Nanog | Abcam | ab80892; RRID:AB_2150114 | |
| 抗FOXA2 | Abcam | ab60721; RRID:AB_941632 | |
| 抗小鼠TBR2/Eomes | Abcam | ab23345; RRID:AB_778267 | |
| 抗Oct4 | Abcam | ab18976; RRID:AB_444714 | |
| 抗Sall4 | Abcam | ab29112; RRID:AB_777810 | |
| ChIP | 抗Oct4 [EPR17929] ChIP级 | Abcam | ab181557 |
| 免疫组织化学 | 抗hCGβ [EPHCGR2] | Abcam | ab131170; RRID:AB_11156864 |
| 免疫荧光 | 抗人细胞核抗体（克隆235-1） | Millipore | MAB1281; RRID:AB_94090 |
| ChIP-seq | 抗三甲基化组蛋白H3（Lys27） | Millipore | 07-449; RRID:AB_310624 |
| 免疫荧光 | 抗平滑肌肌动蛋白（克隆ASM-1） | Millipore | CBL171; RRID:AB_2223166 |
| ChIP-seq | 抗三甲基化组蛋白H3（Lys4） | Millipore | 07-473; RRID:AB_1977252 |
| Western blot | 抗p38 MAPK | Cell Signaling Technology | 9212 also 9212S, 9212L, 9212P; RRID:AB_330713 |
| 抗磷酸化p38 MAPK（Thr180/Tyr182，3D7） | Cell Signaling Technology | 9215 also 9215S, 9215L; RRID:AB_331762 | |
| HRP标记抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 7074; RRID:AB_2099233 | |
| HRP标记抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology | 7076 also 7076S, 7076V, 7076P2; RRID:AB_330924 | |
| 抗β-肌动蛋白（克隆AC-15） | Sigma-Aldrich | A1978; RRID:AB_476692 | |
| 免疫荧光 | 抗KRT8 | Sigma-Aldrich | HPA049866 |
| 抗CDX-2（克隆CDX2-88） | BioGenex | AM392 | |
| 抗细胞角蛋白7（OV-TL 12/30） | Thermo Fisher Scientific | MA5-11986; RRID:AB_10989596 | |
| 抗tdTomato | Biorbyt | orb182397 | |
| Western blot | 抗p44/42 MAPK | Beyotime Technology | AM076 |
| 抗磷酸化p44/42 MAPK | Beyotime Technology | AM071 | |
| 抗JNK/SAPK | Beyotime Technology | AJ518 | |
| 免疫组织化学 | HRP偶联抗兔IgG | ZSGB-BIO | ZDR-5306 |
| Western blot | 抗磷酸化JNK | Beyotime Technology | AM516 |
| 荧光素酶报告基因实验 | pGL4.74 [hRluc/TK]质粒 | Promega | E6921 |
| pGL3-人OCT4 DE-SV40-Luc质粒 | Addgene | 52414 | |
| 体细胞重编程 | pCXLE-hOCT3/4质粒 | Addgene | 27076 |
| pCXLE-hSK质粒 | Addgene | 27078 | |
| pCXLE-hUL质粒 | Addgene | 27080 | |
| pCXLE-EGFP质粒 | Addgene | 27082 | |
| 基因编辑 | Px330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9质粒 | Addgene | 42230 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LCDM化学混合物组成与浓度 | hLIF 10 ng/ml；CHIR 99021人1 μM、小鼠3 μM；DiM 2 μM；MiH 2 μM 阅读提示：Methods中Culture of Human and Mouse EPS Cells |
| 多细胞嵌合注射 | 每胚胎注射10–15个细胞；E2.5（推荐）或E3.5胚胎；约15个注射胚胎移植入每侧子宫角 阅读提示：Methods中Chimeric Assay of Multiple-Cell Microinjection |
| 单细胞嵌合注射 | 单个细胞注入8细胞期ICR二倍体胚胎；室温暴露不超过30 min；注射后培养48–60 hr 阅读提示：Methods中Chimeric Assay of Single-Cell Microinjection；Figure 2E和Figure 3A图注 |
| 四倍体补偿 | 单细胞或10–15个mEPS细胞注入四倍体囊胚；四倍体囊胚由DBA2×C57 F1二细胞期胚胎电融合获得 阅读提示：Methods中Tetraploid Complementation |
| 人EPS细胞种间嵌合检测 | 线粒体PCR阈值1个人细胞/10,000个小鼠细胞；E10.5孕体检测；对照为始发态hPSCs 阅读提示：Results中Interspecies Chimeric Competency of Human EPS Cells及Figure S6E、S6F图注 |
| Parp1敲除验证 | gRNA靶向Parp1外显子1和2；敲除克隆在无MiH的LCDM条件培养 阅读提示：Methods中Generation of Parp1 Knockout mEPS Cell Lines及Figure S7H–S7L图注 |