构建Ssa1 T36磷酸化位点突变酵母菌株
探究T36磷酸化对Ssa1功能和细胞周期的影响。
在ssa1-4Δ背景下表达Ssa1 WT、T36A（非磷酸化模拟）或T36E（磷酸化模拟）作为唯一Ssa蛋白，通过5-FOA置换URA3质粒。
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CDK依赖的Hsp70磷酸化控制G1期周期蛋白丰度与细胞周期进程
CDK-dependent Hsp70 Phosphorylation controls G1 cyclin abundance and cell-cycle progression.
实验完整度
高包含酵母遗传突变体、体外激酶实验、蛋白质组学、哺乳动物细胞过表达等多层级证据，并有功能与机制验证。
主要模型
酿酒酵母ssa1-4Δ菌株表达Ssa1 WT/T36A/T36E HEK293T细胞过表达HaloTag-Hsc70 WT/T38A/T38E
重点核对
酵母菌株：ssa1-4Δ背景，以URA3质粒补偿，经5-FOA置换后仅表达Ssa1 WT、T36A或T36E αF处理：20 μM αF处理2.5小时（用于蛋白质组学） 氮饥饿处理：5小时（用于Pho85相关实验） Cdk1-as1抑制：15 μg/ml nocodazole ± 10 μM 1-NM-PP1处理3小时 哺乳动物细胞转染：HaloTag-Hsc70 WT/T38A/T38E与HA-Cyclin D1 T286A共转染，72小时后检测
摘要
在芽殖酵母中，Hsp70分子伴侣Ssa1–4的基本功能通过表达水平、亚型特异性和共伴侣活性进行调控。我们发现，在Hsp70蛋白中保守的CDK共识位点内，Ssa1 T36的磷酸化改变了共伴侣和客户蛋白的相互作用，提示了一种新的调控范式。T36磷酸化触发Ydj1的置换，使Ssa1能够结合G1期周期蛋白Cln3并促进其降解。在氮饥饿或信息素刺激下，应激CDK Pho85磷酸化T36，使Cln3不稳定从而延迟S期起始。反过来，有丝分裂CDK Cdk1磷酸化T36以阻止Cln3在G2/M期积累。从酵母到人可能广泛保守，Hsc70 T38的CDK依赖磷酸化同样调控Cyclin D1的结合和稳定性。这些结果确立了Hsp70分子伴侣作为信号转导子介导G1期周期蛋白丰度和活性生长控制的积极作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Hsp70分子伴侣是否通过CDK磷酸化调控G1期周期蛋白的丰度和细胞周期进程？
- 核心机制
- CDK（Cdk1和Pho85）磷酸化Ssa1 T36，触发Ydj1解离，促进Ssa1与Cln3结合，导致Cln3降解，从而抑制G1/S转录并延迟S期起始。
- 主要证据
- 酵母遗传学显示T36E突变导致Cln3蛋白减少、G1/S延迟；体外激酶实验证实Cdk1和Pho85磷酸化Ssa1 T36；蛋白质组学揭示T36磷酸化改变Ssa1相互作用组；哺乳动物细胞中Hsc70 T38磷酸化调控Cyclin D1结合和稳定性。
- 研究意义
- 确立了Hsp70分子伴侣作为信号转导子整合环境信号与细胞周期进程，调控G1期周期蛋白丰度；提示Hsc70 T38磷酸化可能作为癌症治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估T36突变对细胞生长和细胞周期的影响
验证T36磷酸化是否影响细胞增殖和G1/S进程。
通过系列稀释点板实验检测温度敏感性；流式细胞术分析DNA含量和细胞大小；氮饥饿同步释放实验检测G1/S进程；αF halo实验检测信息素 arrest。
分析T36磷酸化对Ssa1相互作用组的影响
鉴定T36磷酸化调控的Ssa1相互作用蛋白。
αF处理表达His6-Ssa1 WT或T36A的细胞，纯化相互作用组，进行18O标记和LC-MS/MS定量比较。
验证T36磷酸化对Ydj1和Cln3结合的影响
确定T36磷酸化是否调控Ydj1解离和Cln3结合。
Pull-down实验检测Ydj1和Sis1共沉淀；使用稳定化Cln3（缺失PEST域）检测Ssa1-Cln3结合；Ydj1缺失背景下检测Cln3结合。
鉴定磷酸化Ssa1 T36的CDK
确定Cdk1和Pho85是否磷酸化Ssa1 T36。
体外激酶实验：从nocodazole、氮饥饿或αF处理的细胞中纯化HA-Cdk1或HA-Pho85，与重组His6-Ssa1孵育；体内实验：使用Cdk1-as1菌株和1-NM-PP1抑制；pho85Δ突变体分析。
验证Pho85和Cln3在T36磷酸化下游的作用
确定Pho85是否通过磷酸化T36调控Cln3降解。
在pho85Δ背景下表达Ssa1 WT、T36A或T36E，检测氮饥饿或αF处理下Cln3水平和Ssa1-Cln3结合；体外激酶实验检测Pho85对Cln3的磷酸化。
鉴定Pho85的Pcl周期蛋白伙伴
确定哪些Pcl周期蛋白引导Pho85磷酸化Ssa1。
酵母双杂交实验检测Ssa1-4与Pcl蛋白的相互作用；共沉淀实验检测Clg1/Pcl2与Ssa1的结合；clg1Δ pcl2Δ背景下检测Pho85-Ssa1结合。
验证哺乳动物Hsc70 T38磷酸化的保守功能
检验CDK磷酸化Hsc70是否调控Cyclin D1。
在HEK293T细胞中转染HaloTag-Hsc70 WT、T38A或T38E，检测T38磷酸化、Cyclin D1结合和稳定性、Rb磷酸化及Cyclin A1启动子活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质组学 | His标签分离磁珠 | Invitrogen | -- |
| Western blot | 多克隆山羊抗Cln3抗体 | Santa Cruz Biotechnologies | -- |
| 鸡抗山羊IgG-HRP偶联物 | Millpore | -- | |
| Tetra-HIS抗体 | QIAGEN | -- | |
| 磷酸化苏氨酸-脯氨酸小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling Technologies | -- | |
| 抗小鼠IgG-HRP偶联物 | GE Healthcare | -- | |
| 抗HaloTag多克隆抗体 | Promega | G9281 | |
| 抗兔IgG-HRP偶联物 | GE Healthcare | -- | |
| 磷酸化Rb (Ser780) 抗体 | Cell Signaling | 9307 | |
| Restore Western Blot Stripping Buffer | Thermo | -- | |
| 重组蛋白纯化 | His标签磁珠 | Invitrogen | -- |
| Slide-A-Lyzer透析卡 | Thermo | -- | |
| 体外激酶实验 | 抗HA抗体偶联磁珠 | Sigma | -- |
| Ssa1 ATPase测定 | JN-3000 plus 弗氏压碎器 | JNBIO | -- |
| Chelating Sepharose FF金属亲和树脂 | GE | -- | |
| Superdex 200柱 | GE | -- | |
| Shimadzu UV-2501分光光度计 | Shimadzu | -- | |
| 等温滴定量热法 | ITC200微量热仪 | Microcal | -- |
| 质谱分析 | Thermo LTQ Orbitrap XL质谱仪 | Thermo | -- |
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle最低必需培养基 | Invitrogen | -- |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 青霉素 | Invitrogen | -- | |
| 链霉素 | Invitrogen | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂盒 | Invitrogen | -- |
| HaloTag蛋白纯化 | HaloTag哺乳动物Pull-Down系统 | Promega | -- |
| 荧光素酶报告基因实验 | 荧光素酶报告基因构建体 | GeneCopoeia | -- |
| 定点突变 | Quickchange定点突变试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| αF处理 | 合成α因子肽 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 酵母菌株构建 | ssa1-4Δ背景，URA3质粒补偿，经5-FOA置换后仅表达Ssa1 WT、T36A或T36E 阅读提示：Extended Experimental Procedures, Yeast Culture, Strains, and Plasmids；Figure 1C |
| αF处理 | αF浓度20 μM，处理时间2.5小时（蛋白质组学） 阅读提示：Experimental Procedures, Analysis of the Ssa1 Interactome by Mass Spectrometry |
| 氮饥饿处理 | 氮饥饿时间5小时 阅读提示：Figure 4E, 4G, 5A, 5C, 5D; Extended Experimental Procedures |
| Cdk1-as1抑制 | nocodazole 15 μg/ml，1-NM-PP1 10 μM，处理3小时 阅读提示：Figure 4C; Results |
| 哺乳动物细胞转染 | HEK293T细胞，HaloTag-Hsc70 WT/T38A/T38E与HA-Cyclin D1 T286A共转染，72小时后检测 阅读提示：Figure 6A, 6B; Extended Experimental Procedures, Purification of HaloTag-Hsc70 from HEK293T Cells |