鉴定烟曲霉表面HscA蛋白与宿主细胞结合
筛选能与宿主上皮细胞结合的烟曲霉表面蛋白。
对烟曲霉不同形态进行表面生物素化，提取蛋白与A549细胞孵育，通过免疫荧光和western blot检测结合蛋白，鉴定出HscA。
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烟曲霉劫持人p11将含真菌的吞噬体改道至非降解途径
Aspergillus fumigatus hijacks human p11 to redirect fungal-containing phagosomes to non-degradative pathway.
实验完整度
高多细胞系体外实验、原代细胞、重组蛋白、LC-MS/MS及临床队列SNP关联分析，含功能与机制验证
主要模型
A549人肺上皮细胞系 原代人气道上皮细胞（pAEC） 人肺CD45+细胞及血液中性粒细胞 烟曲霉分生孢子感染模型
重点核对
烟曲霉分生孢子感染复数（MOI）为10，rHscA/rHsp70浓度为10 μg/mL 免疫荧光定量：每实验至少10张图像，至少3次生物学重复 p11敲除（p11-KO）A549细胞及p11敲低（siRNA 125 nM）验证 A2ti-1抑制剂使用浓度100 μM处理2天 临床队列483例异基因造血干细胞移植患者，rs1873311 SNP分型
摘要
哺乳动物细胞内体进入降解途径还是再循环途径的决定对病原体杀伤至关重要，其功能异常会导致病理后果。我们发现人p11是这一决定的关键因子。人病原真菌烟曲霉分生孢子表面的HscA蛋白将p11锚定在含分生孢子的吞噬体（PS）上，排除PS成熟介导因子Rab7，并触发外泌体介导因子Rab11和Sec15的结合。这种重编程将PS改道至非降解途径，使烟曲霉通过向外生长和排出以及分生孢子细胞间转移而逃逸细胞。S100A10（p11）基因非编码区单核苷酸多态性的鉴定支持了临床相关性，该多态性影响对烟曲霉应答中的mRNA和蛋白表达，并与侵袭性肺曲霉病的保护相关。这些发现揭示了p11在介导真菌PS逃逸中的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 烟曲霉如何逃逸宿主细胞的胞内杀伤，以及宿主p11蛋白在吞噬体命运决定中的作用。
- 核心机制
- 烟曲霉表面HscA蛋白与宿主p11（S100A10）结合，将p11锚定在含分生孢子的吞噬体上，稳定AnxA2-p11异四聚体，排除Rab7并招募Rab11和Sec15，使吞噬体改道至非降解的再循环/外泌途径。
- 主要证据
- 通过LC-MS/MS鉴定p11与rHscA共纯化；p11-KO细胞中HscA结合减少；免疫荧光显示p11+吞噬体排除Rab7并招募Rab11/Sec15；活细胞成像观察到分生孢子外排和细胞间转移；临床队列发现rs1873311 SNP与侵袭性肺曲霉病风险降低相关。
- 研究意义
- 揭示了p11作为吞噬体成熟调控节点在真菌免疫逃逸中的作用，并提示p11基因SNP可用于侵袭性肺曲霉病风险分层。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证HscA作为黏附素和效应蛋白的功能
探究HscA在宿主细胞损伤、黏附和吞噬体成熟中的作用。
构建ΔhscA突变株，进行LDH释放实验、黏附和内化实验，检测吞噬体酸化、p47phox和Rab7招募；用rHscA包被乳胶珠验证。
鉴定宿主p11为HscA靶蛋白
寻找与HscA相互作用的宿主蛋白。
用rHscA与A549细胞蛋白提取物孵育，进行链霉亲和素纯化和LC-MS/MS，鉴定p11；用p11-KO细胞和免疫共沉淀验证。
研究p11在吞噬体成熟和分生孢子逃逸中的作用
验证p11对Rab7排除、Rab11/Sec15招募及分生孢子外排的影响。
在p11-KO、p11-KD细胞及A2ti-1处理细胞中感染烟曲霉，免疫荧光检测p11、Rab7、Rab11、Sec15；活细胞成像观察外排和转移。
临床队列分析p11基因SNP与侵袭性肺曲霉病关联
评估p11基因多态性与疾病风险的关联。
在483例异基因造血干细胞移植患者中，对p11基因标签SNP进行分型，分析其与IPA风险的关联；构建A549-T/C细胞系验证SNP功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | F-12K营养混合物培养基 | Gibco | -- |
| 胎克隆III血清 | Cytiva | SH30109 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| LHC-9培养基 | Gibco | 12680013 | |
| SAGM小气道上皮细胞生长培养基试剂盒 | Lonza | CC-3118 | |
| 潮霉素B | InvivoGen | ant-hg-1 | |
| 纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| TrypLE表达酶 | Gibco | 12604-013 | |
| 真菌培养 | 刚果红 | Sigma-Aldrich | C6277 |
| 衣霉素 | Sigma-Aldrich | T7765 | |
| 荧光增白剂 | Sigma-Aldrich | 18909 | |
| 蛋白纯化 | Strep-Tactin XT离心柱试剂盒 | IBA Lifesciences | 2-4151-000 |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素 | Thermo Fisher Scientific | 21335 | |
| Western blot | NuPAGE 4%–12% Bis-Tris凝胶 | Thermo Fisher Scientific | NP0322BOX |
| iBlot 2凝胶转印设备 | Thermo Fisher Scientific | IB21001 | |
| 小鼠单克隆抗p11抗体 | BD | 610071 | |
| 兔单克隆抗Rab7抗体 | Cell Signaling Technology | 9367 | |
| 兔多克隆抗Rab11a抗体 | Cell Signaling Technology | 2413 | |
| 兔多克隆抗Sec15抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-66234 | |
| 免疫荧光 | LysoTracker红色DND-99 | Thermo Fisher Scientific | L7528 |
| 链霉亲和素-Alexa Fluor 488偶联物 | Thermo Fisher Scientific | S11223 | |
| 山羊多克隆抗小鼠IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | |
| 山羊多克隆抗兔IgG (H+L)-DyLight 633 | Thermo Fisher Scientific | 35562 | |
| LC-MS/MS | 胰蛋白酶/Lys-C混合物，质谱级 | Promega | V5071 |
| QExactive HF质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 |
| DharmaFECT 1转染试剂 | Horizon Discovery | T-2001-02 | |
| siRNA | ON-TARGETplus人S100A10 siRNA SMARTpool | Horizon Discovery | L-011766-00-0005 |
| 抑制剂处理 | A2ti-1 | MedChemExpress | HY-136465 |
| 乳胶珠实验 | 红色荧光乳胶珠，平均粒径2.0 μm | Sigma-Aldrich | L3030 |
| 黄绿色荧光乳胶珠，平均粒径1.0 μm | Sigma-Aldrich | L1030 | |
| 磁性乳胶珠，平均粒径1.0 μm | Sigma-Aldrich | 75597 | |
| LDH释放实验 | CyQUANT LDH细胞毒性实验 | Thermo Fisher Scientific | C20300 |
| qPCR | iTaq通用SYBR Green预混液 | Bio-Rad | 1725122 |
| cDNA合成 | Maxima H Minus第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K1651 |
| RNA提取 | 通用RNA纯化试剂盒 | Roboklon | E3598 |
| DNA提取 | PureLink基因组DNA迷你试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K182001 |
| 免疫共沉淀 | GFP-trap磁性琼脂糖 | ChromoTek | gtma-20 |
| Dynabeads蛋白G | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| CD45+细胞分离 | CD45抗体，抗人，生物素，REAfinity | Miltenyi Biotec | 130-110-768 |
| 抗生物素微珠超纯 | Miltenyi Biotec | 130-105-637 | |
| 中性粒细胞分离 | PolymorphPrep分离液 | Progen | -- |
| 红细胞裂解 | 红细胞裂解缓冲液 | Roche | 11814389001 |
| 组织消化 | Dispase（来源于多粘芽孢杆菌） | Corning | 734-1312 |
| 猪胰弹性蛋白酶 | Sigma-Aldrich | E7885 | |
| 牛胰DNase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| 基因分型 | KASPar检测 | LGC Genomics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 烟曲霉感染宿主细胞 | MOI=10；感染时间8 h（A549、H441、pAEC、T7细胞）、3 h（肺CD45+细胞）、2 h（PMNs和PBMCs）；rHscA/rHsp70浓度10 μg/mL 阅读提示：Methods：Infection experiments of cells |
| 免疫荧光定量 | 每实验至少计数10张图像，至少3次生物学重复；p11+吞噬杯百分比计算基于贴附分生孢子 阅读提示：Methods：Immunofluorescence and microscopy |
| p11敲除和敲低 | siRNA浓度125 nM；A2ti-1浓度100 μM处理2天；p11-KO细胞系通过CRISPR/Cas9构建 阅读提示：Methods：Knockdown and knockout of human p11 gene |
| 临床队列SNP分析 | 483例异基因造血干细胞移植患者；rs1873311 SNP；Fine-Gray竞争风险模型校正年龄、性别和显著临床变量 阅读提示：Methods：Genetic association study；SNP selection and genotyping；Quantification and statistical analysis |
| 活细胞成像 | A549细胞5×10^4接种，MOI=5感染4 h；Zeiss LSM 780共聚焦显微镜，20x物镜，4 h拍摄，间隔1-10 s 阅读提示：Methods：Immunofluorescence and microscopy（live cell imaging部分） |