受体结合亲和力测定
比较BA.2.75 RBD与hACE2的结合亲和力，并解析关键突变贡献。
用SPR测定BA.2.75等Omicron亚变异株及早期VOC的RBD与hACE2的亲和力；对BA.2.75 RBD进行单点回复突变（H339D、S446G、K460N、Q493R）并测定亲和力；测定BA.2+N460K RBD亲和力。
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Omicron BA.2.75增强的感染性和抗体逃逸特性
Characterization of the enhanced infectivity and antibody evasion of Omicron BA.2.75.
实验完整度
高包含假病毒中和、SPR/BLI亲和力、热稳定性、cryo-EM结构及DMS等多层级证据，并有功能验证
主要模型
SARS-CoV-2假病毒（VSV系统） HEK293F/293T细胞表达的重组刺突蛋白和RBD Huh-7细胞 疫苗接种者/突破感染康复者血浆
重点核对
假病毒中和试验中血浆样本分组：3剂CoronaVac（n=40）、3剂CoronaVac后BA.1感染（n=50）、BA.2感染（n=39）、2剂CoronaVac后Delta感染（n=16）、3剂CoronaVac后BA.5感染（n=8） SPR和BLI实验重复次数：SPR三次、BLI两次生物学重复 热稳定性实验条件：25 μL反应体系含5 mg蛋白和5000× SYPRO Orange，25°C至99°C以1°C/min升温 cryo-EM数据收集条件：BA.2.75刺突三聚体1.2 mg/mL，pH 7.4和pH 5.5，300 kV Titan Krios，K2或K3 detector 中和试验统计：Wilcoxon符号秩检验，显著性标记*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001
摘要
近期出现的SARS-CoV-2 Omicron亚变异株BA.2.75在印度显示出相对于流行中的BA.2.38、BA.2.76和BA.5的生长优势。然而，其感染性增强的潜在机制，尤其是与BA.5相比，仍不清楚。在此，我们显示BA.2.75对宿主受体血管紧张素转换酶2（ACE2）的亲和力显著高于BA.5和其他变异株。BA.2.75刺突的结构分析显示其热稳定性降低，并且在酸性条件下受体结合域（RBD）处于“up”构象的频率增加，提示低pH内体细胞进入增强。相对于BA.4/BA.5，BA.2.75对BA.1/BA.2突破感染康复者血浆的体液免疫逃逸减少，但对Delta突破感染康复者血浆的逃逸增加。BA.5突破感染血浆对BA.2.75的中和能力也弱于对BA.5，主要由于BA.2.75独特的中和抗体（NAb）逃逸模式。抗体治疗药物Evusheld和Bebtelovimab对BA.2.75仍然有效。这些结果提示BA.2.75可能在BA.4/BA.5之后流行，其增强的受体结合能力可能支持进一步的免疫逃逸突变。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- BA.2.75相对于BA.5等变异株感染性增强的机制及其体液免疫逃逸特征尚不清楚，需评估其受体结合亲和力和免疫逃逸能力。
- 核心机制
- BA.2.75刺突通过R493R回复突变增加与ACE2的氢键，提高受体亲和力；其刺突在酸性pH下RBD“up”构象频率增加且热稳定性改变，提示增强低pH内体细胞进入途径。
- 主要证据
- SPR显示BA.2.75 RBD对hACE2亲和力比其它Omicron变异株高4-6倍；cryo-EM显示pH 5.5下单RBD-up构象占主导；假病毒中和试验显示BA.2.75对BA.5突破感染血浆的中和滴度降低约4倍，且对Delta康复者血浆逃逸强于BA.4/BA.5。
- 研究意义
- 结果提示BA.2.75可能在BA.4/BA.5之后流行，其增强的受体结合能力可能支持进一步的免疫逃逸突变，需密切监测BA.2.75及其亚变异株的传播。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
刺突蛋白结构解析
解析BA.2.75刺突三聚体在中性和酸性pH下的构象，以及与人ACE2、抗体S309和XG2v024的复合物结构。
用cryo-EM测定BA.2.75 S-trimer在pH 7.4和pH 5.5下的结构，以及与hACE2、S309 Fab、XG2v024 Fab的复合物结构。
热稳定性评估
比较BA.1、BA.2、BA.2.12.1、BA.2.75和BA.5刺突及RBD的热稳定性。
用thermofluor稳定性实验检测刺突蛋白在pH 7.4和pH 5.5下的熔解温度，以及RBD在pH 7.4下的稳定性。
假病毒中和试验评估体液免疫逃逸
评估疫苗接种者及不同变异株突破感染康复者血浆对BA.2.75等变异株的中和能力。
用VSV假病毒系统包装SARS-CoV-2变异株刺突，与系列稀释血浆或抗体孵育后感染Huh-7细胞，检测荧光素酶活性计算NT50或IC50。
治疗性抗体及单克隆抗体中和活性测定
评估14种NAb药物及不同表位组NAb对BA.2.75的中和活性。
用假病毒中和试验测定NAb药物和单克隆抗体对BA.2.75、BA.2.76、BA.2.38等的IC50，并用BLI测定S309与RBD的亲和力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Hyclone | SH30243.01 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141C | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Gibco | 15140122 | |
| 0.25%胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 假病毒包装 | G∗ΔG-VSV假病毒 | Kerafast | EH1020-PM |
| 假病毒中和试验 | D-荧光素试剂 | PerkinElmer | 6066769 |
| 蛋白纯化 | Superose 6 Increase 10/300 GL层析柱 | Cytiva | 29091596 |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL层析柱 | Cytiva | 28990944 | |
| 热稳定性实验 | SYPRO Orange蛋白凝胶染料 | Thermo Fisher | S6650 |
| BLI实验 | Protein A生物传感器 | Octet | 18-5010 |
| SPR实验 | CM5生物传感器芯片 | Cytiva | Lot# 10310113 |
| 血浆分离 | Ficoll分离液 | Cytiva | 17-1440-03 |
| 细胞培养 | HEK293F细胞 | Thermo Fisher | 11625019 |
| Huh-7细胞 | Japanese Collection of Research Bioresources [JCRB] | 0403 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 假病毒中和试验 | 血浆样本分组及样本量：3剂CoronaVac（n=40）、3剂CoronaVac后BA.1感染（n=50）、BA.2感染（n=39）、2剂CoronaVac后Delta感染（n=16）、3剂CoronaVac后BA.5感染（n=8）；中和试验至少两次生物学重复 阅读提示：Methods“Pseudovirus neutralization assay”及Figure 5 legend |
| SPR和BLI亲和力测定 | SPR实验重复三次；BLI实验重复两次；CM5芯片固定hACE2；Protein A传感器固定S309 阅读提示：Methods“Surface plasmon resonance”和“Bio-layer interferometry”；Figure 2 legend |
| 热稳定性实验 | 反应体系25 μL含5 mg蛋白和5000× SYPRO Orange；升温25°C至99°C，1°C/min；刺突蛋白pH 7.4和5.5，RBD仅pH 7.4 阅读提示：Methods“Determination of thermal stability”；Figure 3F和4C legend |
| cryo-EM数据收集 | BA.2.75 S-trimer浓度1.2 mg/mL（pH 7.4和5.5）；复合物浓度1.0 mg/mL；300 kV Titan Krios，K2或K3 detector；总剂量60 e− Å−2，32帧，defocus -1.5至-2.7 μm 阅读提示：Methods“Cryo-EM sample preparation and data collection”；Table S1 |
| 深度突变扫描（DMS） | 基于酵母展示的DMS实验条件及表位分组标准：文中未明确说明具体实验条件 阅读提示：Methods未详述，需参考引用的DMS文献及Table S3 |