病毒培养与纯化
获得可用于结构分析的CVB1成熟病毒粒子和空粒子。
CVB1 301株在RD细胞中培养，PEG沉淀后经15%-45%蔗糖密度梯度超速离心，收集两条带并透析浓缩，SDS-PAGE和负染电镜鉴定。
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冷冻电镜结构揭示受体启动柯萨奇病毒脱壳的分子基础
Cryo-EM structures reveal the molecular basis of receptor-initiated coxsackievirus uncoating.
实验完整度
高五个高分辨率冷冻电镜结构、体外PaSTRy和细胞结合/中和实验、小鼠体内保护实验。
主要模型
CVB1 301株成熟病毒粒子 CVB1-301与CAR复合物 CVB1-301与5F5 Fab免疫复合物 BALB/c小鼠CVB1感染模型
重点核对
CVB1-M与CAR质量比1:1，4°C或37°C孵育10分钟，pH 7.4 CVB1-M与5F5 Fab质量比1:10，37°C孵育10分钟或120分钟 1日龄BALB/c小鼠腹腔注射10 TCID50 CVB1，12小时后腹腔注射抗体10、1或0.1 μg/g 中和实验使用100 TCID50 CVB1 301或Conn-5株，37°C孵育1小时 PaSTRy使用1 μg CVB1-M和5 μM SYTO 9，25°C至99°C记录荧光
摘要
肠道病毒脱壳受体结合在环绕每个衣壳顶点的表面凹陷（“峡谷”）处，导致埋藏于主要病毒衣壳蛋白VP1形成的疏水口袋中的宿主来源脂质“口袋因子”释放。柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）是B组柯萨奇病毒（CVB）的通用脱壳受体。在此，我们展示了代表病毒感染不同阶段的五个高分辨率CVB冷冻电镜结构。结构比较显示，CAR比其它脱壳受体更深入地穿透峡谷，引发级联事件：与低pH相比，在中性pH下VP1疏水口袋塌陷、口袋因子高效释放以及病毒脱壳和基因组释放。此外，我们鉴定了一种强效治疗性抗体，可通过干扰病毒粒子-CAR相互作用、使衣壳失稳并诱导病毒粒子破坏来中和病毒感染。总之，这些结果定义了CVB细胞进入和抗体中和的结构基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CAR如何在中性pH下介导B组柯萨奇病毒脱壳，以及能否据此开发靶向受体结合位点的中和抗体。
- 核心机制
- CAR的D1结构域深入峡谷，与VP1 GH loop等接触，诱导VP1 GH loop下移约2.5 Å，排挤口袋因子，导致口袋塌陷、衣壳扩展和基因组释放；5F5通过空间位阻阻断CAR结合并模拟脱壳受体使衣壳失稳。
- 主要证据
- 五个高分辨率冷冻电镜结构（CVB1-M、CVB1-E、CVB1-M:CAR_4、CVB1-M:CAR_37、CVB1-A）及CVB1-M:5F5结构，结合PaSTRy、细胞结合RT-PCR、中和实验和体内保护实验。
- 研究意义
- 为理解CVB细胞进入和抗体中和提供结构基础，并展示受体导向发现治疗性抗体的策略，为CVB及其他小RNA病毒防治策略提供信息。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
冷冻电镜结构解析
解析CVB1不同状态及与CAR、5F5复合物的高分辨率结构。
制备CVB1-M、CVB1-E、CVB1-M:CAR_4、CVB1-M:CAR_37、CAR触发的A粒子和CVB1-M:5F5复合物，进行冷冻电镜数据采集、三维重建和原子模型搭建。
CAR介导脱壳的生化验证
验证CAR结合是否在体外中性条件下促进病毒RNA暴露和脱壳。
使用PaSTRy检测CAR结合后病毒基因组RNA的温度依赖性暴露，负染电镜观察CAR处理后A粒子和空粒子比例变化。
细胞结合与中和实验
评估CAR和5F5对病毒附着及感染的阻断效果。
在RD细胞上进行预附着和后附着抑制实验，RT-PCR定量细胞结合病毒RNA，微量中和实验计算IC50。
5F5抗体制备与筛选
通过CAR竞争策略获得靶向CAR结合位点的中和抗体。
BALB/c小鼠皮下免疫CVB1成熟病毒粒子，脾细胞与Sp2/0融合，通过CAR竞争ELISA和微量中和实验筛选单克隆抗体5F5，并构建嵌合及人源化抗体。
体内保护实验
评估5F5和hu5F5-2对CVB1致死感染的保护效果。
1日龄BALB/c小鼠腹腔注射CVB1后12小时腹腔注射不同剂量抗体，每日监测生存至感染后20天。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞结合与中和
评估体内保护效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 病毒纯化 | 聚乙二醇6000 | -- | -- |
| Ultra-4离心浓缩器（100 kDa） | Millipore | -- | |
| CAR蛋白纯化 | Ultra-15离心浓缩器（10 kDa） | Millipore | -- |
| 蛋白A层析 | Bestchrom | -- | |
| 抗体纯化 | 蛋白A层析 | Bestchrom | -- |
| AT蛋白A Diamond | Bestchrom | AA0273 | |
| DEAE-5PW (20) | TOSOH | 14711 | |
| 细胞培养 | 最低必需培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| FreeStyle™ 293表达培养基 | Gibco | -- | |
| 转染 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 23966-2 |
| PaSTRy实验 | SYTO® 9荧光染料 | Thermo Fisher | S34854 |
| MX3005p RT-PCR仪 | Agilent | -- | |
| RNA提取 | QIAamp Mini病毒RNA提取试剂盒 | Qiagen | 52904 |
| SDS-PAGE | NuPAGE™ 4-12% Bis-Tris蛋白凝胶 | Thermo Fisher | NP0321BOX |
| 表面等离子共振 | BIAcore 8K仪器 | GE Healthcare | -- |
| Series S Protein G传感芯片 | GE Healthcare | 29179315 | |
| 负染电镜 | FEI Tecnai T12透射电子显微镜 | FEI | -- |
| 200目碳包被载网 | -- | -- | |
| 冷冻电镜 | Quantifoil铜载网（R2/2，200目） | Quantifoil Micro Tools | Q2100CR2 |
| Vitrobot Mark IV冷冻制样仪 | FEI | -- | |
| Falcon-2直接电子探测器 | -- | -- | |
| Falcon-3直接电子探测器 | -- | -- | |
| 分子克隆 | EndoFree Maxi质粒试剂盒 | TianGen | DP117 |
| DH5α感受态细胞 | TianGen | CB101 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒培养与纯化 | MOI 0.1、37°C培养72小时、PEG 6000浓度6%、NaCl浓度0.3 M、蔗糖梯度15%-45%、120,000×g离心3.5小时 阅读提示：Methods“Virus production and purification”小节及Figure S1 |
| 冷冻电镜样品制备 | CVB1-M:CAR质量比1:1、孵育温度4°C或37°C、孵育时间10分钟、CVB1-M:5F5 Fab质量比1:10、5F5孵育时间10或120分钟、缓冲液pH 7.4 阅读提示：Methods“CryoEM sample preparation and data collection”小节及Figure 1、Figure 6图注 |
| PaSTRy实验 | 1 μg CVB1-M、5 μM SYTO 9、50 μL反应体系、25°C至99°C、0.5°C间隔、CAR 1 μg或不同浓度Fab-5F5预孵育37°C 10分钟 阅读提示：Methods“PaSTRy assay”小节及Figure 1F、Figure 6F图注 |
| 细胞结合与中和实验 | RD细胞1×10^4细胞/孔、100 TCID50病毒、预附着4°C 1小时、后附着4°C 1小时、CAR初始浓度0.01 mg/mL、5F5初始浓度0.1 mg/mL、37°C孵育3-5天 阅读提示：Methods“Pre- and post-attachment inhibition assays”和“In vitro neutralization assays”小节及Figure 1G-1H、Figure 6G-6H图注 |
| 体内保护实验 | 1日龄BALB/c小鼠、n=6-8、10 TCID50 CVB1腹腔注射、感染后12小时抗体腹腔注射、剂量10、1或0.1 μg/g体重、监测至20天 阅读提示：Methods“In vivo protection assay”小节及Figure 5F图注 |