分离针对 adherent invasive E. coli 的噬菌体
从人类肠道微生物群中分离针对AIEC的噬菌体，用于后续功能研究。
从IBD患者粪便样本中，以E. coli NC101为富集宿主分离噬菌体，经过纯化和测序，选择三株易于扩增的噬菌体（NC-A、NC-B、NC-G）。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
噬菌体的扩增与肠道炎症和结肠炎的加重相关
Expansion of Bacteriophages Is Linked to Aggravated Intestinal Inflammation and Colitis.
实验完整度
高包含无菌小鼠、基因敲除小鼠、APCmin肿瘤模型、DSS结肠炎模型及患者样本等多层级验证，并明确TLR9/IFN-γ机制验证。
主要模型
无菌小鼠（Swiss Webster和C57Bl/6） APCmin小鼠结直肠癌模型 DSS诱导结肠炎小鼠模型 活动性溃疡性结肠炎患者粪便样本
重点核对
无菌小鼠经饮用水中给予噬菌体鸡尾酒（约3×10^7 PFU/天）处理， effects on CD4+ T cells和IFN-γ产生 TLR9−/−和TLR3−/−树突状细胞与噬菌体共培养后CD4+ T细胞IFN-γ产生 APCmin小鼠定植E. coli NC101后噬菌体处理70天，肿瘤大小和生存率 DSS结肠炎小鼠经噬菌体预处理3-4周后，体重损失和组织学评分 UC患者FMT前后Caudovirales噬菌体相对丰度与临床反应及黏膜IFN-γ相关性
摘要
噬菌体是微生物群中最丰富的成员，具有塑造肠道细菌群落的潜力。噬菌体组成的变化与疾病相关，但噬菌体如何影响哺乳动物健康仍不清楚。我们注意到在实验性治疗细菌驱动的癌症时宿主免疫被诱导，这促使我们测试噬菌体是否改变免疫反应。用噬菌体处理无菌小鼠导致肠道免疫细胞扩增。乳杆菌、埃希菌和拟杆菌噬菌体以及噬菌体DNA通过核苷酸感应受体TLR9刺激IFN-γ。由此产生的免疫反应既是噬菌体特异性的也是细菌特异性的。此外，增加噬菌体水平通过TLR9和IFN-γ加剧结肠炎。同样，对粪便微生物群移植（FMT）有反应的溃疡性结肠炎（UC）患者与无反应者相比噬菌体减少，且黏膜IFN-γ与噬菌体水平正相关。活动性UC患者的噬菌体与健康个体相比诱导更多的IFN-γ。总的来说，这些结果表明噬菌体可以改变黏膜免疫以影响哺乳动物健康。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 噬菌体是否直接影响哺乳动物免疫系统，以及这种免疫刺激在肠道炎症和结肠炎中的作用。
- 核心机制
- 噬菌体DNA通过树突状细胞内的TLR9受体刺激IFN-γ产生，进而加剧结肠炎；该过程不依赖TLR3。
- 主要证据
- 无菌小鼠中噬菌体处理导致肠道CD4+和CD8+ T细胞扩增及IFN-γ产生增加；TLR9−/−树突状细胞共培养丧失IFN-γ诱导；TLR9−/−和IFN-γ−/−小鼠中噬菌体加剧DSS结肠炎的作用消失；UC患者黏膜IFN-γ与噬菌体丰度正相关。
- 研究意义
- 噬菌体作为肠道微生物群的组成部分，能够改变黏膜免疫并影响哺乳动物健康，提示其在炎症性肠病等疾病中的潜在作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证噬菌体在体内减少AIEC定植
测试噬菌体是否能在体内减少AIEC的定植。
无菌小鼠定植包含E. coli NC101的菌群后，通过饮用水给予噬菌体鸡尾酒，监测粪便和肠道组织中的E. coli NC101水平。
评估噬菌体对细菌加剧的结直肠癌模型的影响
测试噬菌体是否能预防AIEC加剧的肠道肿瘤生长。
APCmin小鼠给予噬菌体鸡尾酒（约3×10^7 PFU/天）并通过口服灌胃定植E. coli NC101，监测肿瘤数量和大小、生存率及基因表达。
验证噬菌体对无菌小鼠免疫系统的直接刺激
确定噬菌体是否能直接刺激哺乳动物免疫系统而不依赖细菌。
无菌小鼠通过饮用水给予纯化的E. coli噬菌体鸡尾酒或T4噬菌体4周，通过流式细胞术分析肠道相关淋巴组织中的免疫细胞比例和数量。
阐明噬菌体DNA通过TLR9激活IFN-γ的机制
确定噬菌体刺激免疫系统的分子机制。
体外共培养树突状细胞和CD4+ T细胞，使用TLR3−/−和TLR9−/−树突状细胞、纯化噬菌体DNA、热灭活噬菌体、空衣壳等，检测IFN-γ和IL-12产生。
验证噬菌体加剧DSS结肠炎及TLR9/IFN-γ依赖性
测试增加噬菌体丰度是否加剧肠道结肠炎，并确定TLR9和IFN-γ的作用。
SPF野生型、TLR9−/−和IFN-γ−/−小鼠给予噬菌体鸡尾酒3-4周后，用2.5% DSS诱导结肠炎，监测体重、组织学和免疫细胞反应。
分析UC患者噬菌体丰度与FMT反应及IFN-γ的相关性
在人类中验证噬菌体与黏膜免疫及FMT临床反应的关系。
对20名活动性UC患者FMT前后粪便进行病毒核酸测序，分析Caudovirales噬菌体相对丰度与临床反应及直肠黏膜CD4+ T细胞IFN-γ产生的相关性；分离VLPs刺激树突状细胞与naive CD4+ T细胞共培养。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 噬菌体分离与纯化 | 含钙镁的HBSS | Corning Cellgro | 21-023-CV |
| 氯仿 | Fisher Chemical | C298-500 | |
| 氯化铯 | Fisher BioReagents | BP210-100 | |
| Quickseal离心管 | Beckmann | 344059 | |
| 10K MWCO透析袋 | ThermoFisher Scientific | 68035 | |
| LPS浓度测定 | LAL显色内毒素定量试剂盒 | Pierce | 88282 |
| EndoZyme内毒素检测试剂 | Hyglos HmbH | 890030 | |
| 噬菌体DNA分离 | 噬菌体DNA分离试剂盒 | Norgen | 46800 |
| 细菌DNA提取 | PowerFecal DNA分离试剂盒 | Qiagen | 12830-50 |
| RNA提取与RT-qPCR | RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | 74106 |
| qScript cDNA合成预混液 | QuantaBio | 101414-106 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master混合液 | Roche | 04707516001 | |
| 流式细胞术 | CD4 FITC抗体 | eBiosciences | 11-0042-82 |
| CD8 PerCp-Cyanine5.5抗体 | eBiosciences | 45-0081-82 | |
| IFN-γ PE抗体 | Biolegend | 505807 | |
| 细胞培养 | 重组小鼠GM-CSF | Biolegend | 576306 |
| RPMI 1640培养基 | Thomas Scientific | C838R34 | |
| 胎牛血清 | HyClone | SH30071.03 | |
| 流式细胞术 | 离子霉素 | Sigma Aldrich | I3909-1ML |
| 佛波酯 | Fisher Biosciences | BP685-1 | |
| 布雷菲德菌素A | Biolegend | 420601 | |
| ELISA | IL-12/IL-23 p40（总）小鼠未包被ELISA试剂盒 | Invitrogen | 88-7120-88 |
| IFN-γ小鼠ELISA试剂盒 | Invitrogen | KMC4022 | |
| 小鼠IgA ELISA试剂盒 | Invitrogen | EMIGA | |
| DSS结肠炎诱导 | 葡聚糖硫酸钠盐 | MP Biomedicals | 0216011010 |
| 病毒核酸提取 | MagMax病毒RNA分离试剂盒 | Thermo Fisher | AM1939 |
| SuperScript II逆转录酶 | Thermo Fisher | 18064014 | |
| AccuPrime Taq DNA聚合酶系统 | Thermo Fisher | 12339016 | |
| 共聚焦显微镜 | 鬼笔环肽-AlexaFluor680 | Thermo-Fisher | A22286 |
| 组蛋白2B-RFP | Thermo-Fisher | C10595 | |
| SYBR Green染料 | Thermo-Fisher | S33102 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 噬菌体处理无菌小鼠 | 噬菌体剂量：约3×10^7 PFU/天；给药方式：饮用水；处理时间：4周；小鼠品系：Swiss Webster和C57Bl/6；对照：热灭活噬菌体和 vehicle control。 阅读提示：Methods 'Germ-free animal experiments' 和 Figure 3 legend。 |
| APCmin肿瘤模型 | 小鼠年龄：4周开始；噬菌体处理时间：70天；E. coli NC101定植方式：口服灌胃100 μL，biweekly for 2 weeks；样本量：每组n=6-20不等。 阅读提示：Methods 'APCmin cancer model experiment' 和 Figure 2 legend。 |
| DSS结肠炎模型 | 噬菌体预处理时间：3-4周；DSS浓度：2.5%；DSS处理时间：7天；小鼠品系：SPF C57Bl/6、TLR9−/−、IFN-γ−/−；组织学评分标准。 阅读提示：Methods 'DSS colitis experiments' 和 Figure 6 legend。 |
| 树突状细胞-T细胞共培养 | 噬菌体MOI：10；共培养时间：72小时；细胞比例：1×10^5 DCs 与 5×10^5 CD4+ T细胞；检测指标：IFN-γ和IL-12。 阅读提示：Methods 'Dendritic cell – T cell co-culture experiments' 和 Figure 4 legend。 |
| UC患者FMT研究 | 患者数量：20；样本采集时间：FMT前和FMT后4周；病毒测序方法：VirMAP；临床反应定义：ΔMayo score ≥3 和 bleeding subscore ≤1。 阅读提示：Methods 'Human IBD Subjects' 和 Figure 7 legend。 |