iPSC分化为脊髓运动神经元祖细胞和脑微血管内皮样细胞
获得用于芯片共培养的spNPCs和iBMECs。
iPSC经双SMAD和GSK3β抑制指定神经命运，加入Shh激动剂和视黄酸指定脊髓运动神经元祖细胞，再加入神经营养因子和Notch通路拮抗剂促进成熟；iBMECs经Wnt激活、内皮祖细胞指定和视黄酸处理分化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
使用iPSC来源的脊髓运动神经元和整合的血脑屏障样屏障构建散发性ALS器官芯片模型
An organ-chip model of sporadic ALS using iPSC-derived spinal cord motor neurons and an integrated blood-brain-like barrier.
实验完整度
高包含iPSC来源运动神经元与内皮样细胞的体外器官芯片模型、批量转录组/蛋白质组、单核RNAseq及复制批次验证，并有功能与机制层面分析。
主要模型
iPSC来源的脊髓运动神经元祖细胞（spNPCs）分化芯片 iPSC来源的脑微血管内皮样细胞（iBMECs）共培养的SC-chip 96孔板spNPC单培养对照
重点核对
SC-chip中spNPCs接种密度12E6 cells/ml，第14天加入iBMECs，第28天终点 media flow速率约6μl/hr（平均5.88μl/hr），相当于每3.2小时神经通道总体积更换一次 sALS组为5例年轻男性散发性ALS患者iPSC系，对照组为5例健康男性（包括4例Lothian Birth Cohort） snRNAseq发现队列4例对照（n=5样本）和6例ALS（n=6样本），复制队列4例对照和5例ALS亚组 批量转录组和蛋白质组各使用4个独立实验的芯片，n=5对照（2样本/患者）、n=4 ALS（2样本/患者）
摘要
肌萎缩侧索硬化（ALS）是一种致命的神经退行性疾病，大脑和脊髓中的运动神经元死亡导致瘫痪。从患者特异性多能干细胞（iPSCs）生成运动神经元（MNs）可能有助于阐明疾病的早期阶段。在这里，我们将来自早发型疾病患者的运动神经元与脑微血管内皮样细胞结合在一个我们称为脊髓芯片（SC-chips）的微流控装置中，并加入培养基流动，这增强了神经元成熟并改善了细胞健康。SC-chips的批量转录组学和蛋白质组学分析揭示了对照与ALS之间的差异，包括神经丝水平升高。单核RNA测序揭示了两个MN亚群的存在以及谷氨酸能和突触信号传导的ALS特异性失调。这种ALS SC-chip模型生成了多样化的成熟运动神经元，以便在一个具有活跃的血脑屏障样系统的模型中更好地理解ALS病理，用于未来的药物筛选。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用iPSC来源的脊髓运动神经元与iBMECs在微流控器官芯片中构建散发性ALS体外模型，并揭示早期疾病相关分子表型？
- 核心机制
- sALS运动神经元中谷氨酸能受体和突触信号相关基因上调、GABA受体亚基下调，提示兴奋性/抑制性平衡失调；同时神经丝（如NEFH、NEFL）和NRGN表达升高。
- 主要证据
- SC-chip批量转录组和蛋白质组显示sALS中NEFH蛋白和NRGN升高；snRNAseq分辨出MNX1+和PHOX2B+运动神经元亚群，发现谷氨酸受体和突触相关基因富集，并在复制批次中验证GRIN2A等基因上调。
- 研究意义
- 该模型可生成多样化成熟运动神经元并具有功能性血脑屏障样系统，有助于理解散发性ALS病理和未来药物筛选。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SC-chip构建与培养
在微流控芯片中建立神经通道和血管通道共培养体系，并比较静态与灌流条件。
Emulate芯片上通道用Matrigel包被，下通道用胶原IV:水:纤连蛋白（4:5:1）包被；spNPCs接种于上通道，第14天在下通道加入iBMECs；静态芯片隔天换液，灌流芯片以约6μl/hr流速培养至第28天。
灌流对神经组织生长和细胞健康的影响评估
验证培养基流动是否增强神经组织生长和细胞健康。
相差成像观察活细胞，横截面免疫组化染色SMI32和Ki67，量化组织厚度和Ki67+细胞比例，并进行批量转录组分析。
sALS与对照SC-chip的批量转录组和蛋白质组比较
识别散发性ALS与对照之间的基因和蛋白表达差异。
使用5例对照和4例sALS iPSC系构建SC-chip，第28天提取组织进行批量RNAseq和蛋白质组学，分析差异表达基因和蛋白。
snRNAseq解析SC-chip细胞组成和运动神经元亚群
在单核水平解析芯片中细胞类型、运动神经元发育轨迹和ALS相关差异。
提取细胞核，10x Chromium NextGEM 3’建库测序，Seurat聚类和UMAP分析，Monocle3拟时序分析，亚群差异表达和GO富集分析。
SC-chip与96孔板培养的运动神经元成熟度比较
验证芯片环境是否促进运动神经元成熟并产生更接近体内的运动神经元。
96孔板培养spNPCs 28天，snRNAseq并与SC-chip数据比较，将运动神经元与体内人和小鼠运动神经元数据做相关性分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| SC-chip培养 | Emulate芯片 | Emulate | -- |
| 芯片包被 | 基质胶 | Corning | 354230 |
| IV型胶原蛋白 | Sigma Aldrich | C5533 | |
| 纤连蛋白 | Sigma Aldrich | F1141 | |
| 细胞培养 | Accutase细胞解离液 | Sigma-Aldrich | SCR005 |
| 免疫染色 | 小鼠抗SMI-32/神经丝H抗体 | Biolegend | 801701 |
| 山羊抗人Islet-1/ISL1抗体 | R&D Systems | AF1837 | |
| 抗Ki67抗体[SP6]（FITC） | Abcam | ab27619 | |
| 驴抗小鼠IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | |
| 驴抗兔IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 647 | Thermo Fisher Scientific | A31573 | |
| 驴抗山羊IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ Plus 594 | Thermo Fisher Scientific | A32758 | |
| DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚，二乳酸盐） | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| RNA提取 | RNeasy微量RNA提取试剂盒 | Qiagen | 4004 |
| RNA质量控制 | Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- |
| cDNA文库构建 | IDT xGen宽范围RNA文库制备试剂盒 | Integrated DNA Technologies | -- |
| SMART-Seq V4超低RNA输入测序试剂盒 | Takara Bio USA, Inc. | -- | |
| Nextera XT文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| mRNA富集 | NEBNext Poly(A) mRNA磁珠分离模块 | New England Biolab | -- |
| rRNA去除 | Lexogen RiboCop人/鼠/大鼠rRNA去除试剂盒v2 | Lexogen | -- |
| 测序 | NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| 单核RNAseq | Chromium NextGEM单细胞3’试剂盒v3.1 | 10x Genomics | -- |
| Chromium Next GEM芯片G | 10x Genomics | -- | |
| 高灵敏度DNA芯片 | Agilent | -- | |
| Collibri文库定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白质组学 | Pierce BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 |
| 胰蛋白酶/Lys-C混合物，质谱级 | Promega | V5071 | |
| Oasis HLB 96孔板 | Waters | -- | |
| Eksigent 415液相色谱系统 | Eksigent | -- | |
| Sciex tripleTOF 6600质谱仪 | Sciex | -- | |
| LDH检测 | CyQUANT LDH细胞毒性检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C20301 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SC-chip构建与培养 | spNPCs接种密度12E6 cells/ml；iBMECs在第14天加入下通道；灌流速率约6μl/hr，相当于每3.2小时神经通道总体积更换一次；第28天终点；静态条件隔天换液 阅读提示：STAR Methods中SC-chip culture小节及图1a |
| sALS与对照SC-chip批量转录组和蛋白质组 | 5例对照和4例sALS iPSC系；ALS5因QC未通过被排除；批量转录组和蛋白质组各4个独立实验；n=5对照（2样本/患者）、n=4 ALS（2样本/患者） 阅读提示：Results中Sporadic ALS lines show disease-specific signatures in the SC-chip小节及图2图注 |
| snRNAseq发现队列 | 4例对照（n=5样本）和6例ALS（n=6样本）；共49,422个细胞核通过QC；每样本约4,493个细胞核，中位3,651个基因/核 阅读提示：Results中snRNAseq of SC-chips resolves cellular stages of motor neuron development小节及图3图注 |
| snRNAseq复制队列 | 4例对照和5例ALS亚组；38,260个细胞核通过QC；与发现队列合并分析时共9,488个运动神经元（sALS n=6,025，对照n=3,463） 阅读提示：Results中Focusing on motor neurons reveals that specific excitotoxic pathways are disrupted in ALS小节及补充图4 |
| SC-chip与96孔板比较 | 3例对照（CTR4、CTR7、CTR8）和3例sALS（ALS1、ALS8、ALS9）；3复孔/系，每系3孔合并进行RNA分离；培养28天 阅读提示：Results中The organ-chip environment enhances motor neuron differentiation when compared to 96-well plates小节及图4图注 |