Tn/mem来源iPSC的建立与CD19-CAR工程化
获得无整合、多能性确认且稳定表达CD19-CAR的克隆化iPSC。
从健康供者外周血分离CD62L+ Tn/mem，用游离体质粒重编程为iPSC，克隆筛选并以碱性磷酸酶、SSEA3/4、TRA1-60/81、CD30和EBNA PCR确认；随后用临床级CD19-CAR慢病毒转导并单细胞分选、克隆化、扩增和建库。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
3D类器官培养支持人CAR+ iPSCs分化为高功能CAR T细胞
3D-organoid culture supports differentiation of human CAR+ iPSCs into highly functional CAR T cells.
实验完整度
高含体外细胞系杀伤、脱颗粒、细胞因子、信号检测及小鼠异种移植体内抗肿瘤验证，多层级证据并含功能验证
主要模型
Tn/mem来源的CD19-CAR+ iPSC系 PBMC来源的常规CD19-CAR T细胞 CD19+ NALM6等肿瘤细胞系 NSG小鼠NALM6异种移植模型
重点核对
iPSC经CD19-CAR慢病毒转导后单细胞分选并克隆化，确认CAR+并维持干细胞标志物 PSC-ATO分化流程：3天中胚层诱导、CD56+ iMP富集、iMO 14天、T细胞分化5–7周后REM扩增14天 体外杀伤使用CD19+与CD19KO的NALM6、Raji、3T3及患者ALL细胞，E:T比与4h/48h终点需核对 体内模型：NSG小鼠i.p.或i.v.接种2.5×105 ffluc+ NALM6，CAR T剂量5–6×106，肿瘤负荷用生物发光成像 CAR表达用EGFRt流式检测，TCR克隆性用TCR Vβ流式和TCRB PCR评估
摘要
从人诱导多能干细胞（iPSCs）无限生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞是实现“现货型”CAR T细胞免疫治疗的一种有吸引力的途径。然而，高效地将iPSCs分化为经典αβ T细胞谱系、同时维持CAR表达和功能的方法一直充满挑战。我们报道，将CD62L+初始和记忆T细胞重编程为iPSCs，随后进行CD19-CAR工程改造和3D类器官系统分化，可获得具有常规CD8αβ阳性CAR T细胞特征的产品。扩增的iPSC CD19-CAR T细胞显示出与常规CD19-CAR T细胞相当的抗原特异性激活、脱颗粒、细胞毒性和细胞因子分泌，并维持源自初始克隆的TCR的同质性表达。iPSC CD19-CAR T细胞还在体内介导了强效的抗肿瘤活性，延长了携带CD19+人肿瘤异种移植小鼠的生存期。我们的研究建立了从iPSCs生成高功能CAR T细胞的可行方法，以支持“现货型”生产策略的开发。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否利用Tn/mem来源的CAR+ iPSCs和3D类器官培养系统，生成具有常规T细胞表型和高功能的CAR T细胞。
- 核心机制
- PSC-ATO 3D类器官培养驱动CAR+ iPSCs分化为CD8αβ+常规T细胞；分化过程中EF1α启动子超甲基化导致CAR转基因表达下调，使静息状态激活信号较低，但抗原刺激后信号和杀伤功能仍强。
- 主要证据
- iPSC CD19-CAR T细胞与常规CD19-CAR T细胞表型相似，体外对CD19+肿瘤细胞杀伤、脱颗粒、IFNγ和Th1细胞因子分泌相当；小鼠i.p.和i.v. NALM6异种移植中延缓肿瘤进展并延长生存期。
- 研究意义
- 建立了从iPSCs生成高功能CAR T细胞的可行方法，支持“现货型”CAR T细胞生产策略的开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PSC-ATO 3D类器官定向分化
将CAR+ iPSC依次诱导为中胚层祖细胞、造血祖细胞并分化为T细胞。
iPSC先在中胚层诱导培养基中培养3天，磁选CD56+CD326- iMP，与MS5-hDLL4饲养细胞聚集形成iMO培养14天，再切换ATO培养基进行T细胞分化5–7周。
REM扩增与表型鉴定
将分化所得T细胞扩增至临床相关数量并确认常规T细胞表型。
收获iMO-ATO来源T细胞，用 irradiated PBMC和LCL细胞在anti-CD3、IL-2、IL-7条件下REM扩增14天，随后流式检测CD3/CD5/CD7/TCRαβ/CD8αβ及记忆标志物，并用EGFRt检测CAR表达。
体外抗原特异性功能与信号验证
验证iPSC CD19-CAR T细胞对CD19+靶细胞的杀伤、脱颗粒、细胞因子分泌和信号激活。
与CD19+或CD19KO的NALM6、Raji、3T3及患者ALL细胞共培养，流式或荧光素酶法测杀伤，流式测CD107a、IFNγ、CD25、CD137，Bio-Plex测细胞因子，Western blot测ERK、PLCγ、CD3ζ磷酸化。
体内抗肿瘤效果评估
评估iPSC CD19-CAR T细胞在NALM6异种移植模型中的抗肿瘤活性和生存获益。
NSG小鼠i.p.或i.v.接种ffluc+ NALM6，随后给予iPSC CD19-CAR T、Mock T或常规CAR T，部分联合irradiated NS0-hIL15或扩增时AKT抑制剂AZD5363，用生物发光成像和生存期评估。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| iPSC重编程 | 人T细胞核转染试剂盒 | Lonza | -- |
| Nucleofector 4D电转仪 | Lonza | -- | |
| 细胞培养 | mTeSR1培养基 | StemCell Technologies | 85850 |
| Matrigel hESC合格基质胶 | Corning | 354277 | |
| CloneR添加剂 | StemCell Technologies | 5889 | |
| StemPro Accutase细胞解离试剂 | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
| iPSC转导 | 硫酸鱼精蛋白 | APP Pharmaceuticals | NDC 63323–229-05 |
| T细胞扩增 | Dynabeads人T细胞扩增CD3/CD28磁珠 | ThermoFisher Scientific | 11141D |
| Proleukin（阿地白介素）重组人IL-2 | Novartis Oncology | NCD 65483–116-07 | |
| 重组人IL-15 | CellGenix, US Operations | 1413–050 | |
| 重组人IL-7 | Peprotech | AF-200–07 | |
| iMP富集 | EasySep人CD56阳性选择试剂盒II | Stem Cell Technologies | 17855 |
| 中胚层诱导 | 激活素A | R&D Systems | 338-AC-010 |
| 重组人BMP-4 | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| 重组人VEGF | R&D Systems | 293-VE-010 | |
| 重组人碱性FGF | Peprotech | AF-100–18B | |
| iMO培养 | TGFβ-RI抑制剂SB-431542 | StemCell Technologies | 72234 |
| 重组人Flt3配体 | Peprotech | AF-300–19 | |
| 重组人TPO | Peprotech | 300–18 | |
| 重组人SCF | Peprotech | AF-300–07 | |
| 类器官培养 | Millicell细胞培养插片 | Millipore Sigma | PICM0RG50 |
| T细胞分化 | B-27添加剂（50X） | ThermoFisher Scientific | 17504–044 |
| L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物 | Sigma | A8960 | |
| 流式分析 | IOTest beta Mark TCR Vβ谱试剂盒 | Beckman Coulter | IM3497 |
| TCR克隆性检测 | TCRB T细胞克隆性检测试剂盒 | Invivoscribe | 12000011 |
| RNA提取 | Quick-RNA微量提取试剂盒 | Zymo Research | R1050 |
| 亚硫酸氢盐转化 | EZ DNA甲基化-Lightning试剂盒 | Zymo Research | D5030 |
| 免疫组化 | 固定/透化溶液试剂盒 | BD Biosciences | 554714 |
| 流式分析 | Brefeldin A高尔基体阻断剂 | BD Biosciences | 555029 |
| 细胞因子检测 | Luminex小鼠细胞因子磁珠10重检测panel | ThermoFisher Scientific | LMC0001M |
| 体内成像 | XenoLight D-荧光素钾盐 | PerkinElmer | 122799 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| iPSC来源与CAR工程化 | Tn/mem来源供者、重编程质粒组合、CD19-CAR慢病毒MOI=1、单细胞分选与克隆化 阅读提示：Methods中Tn/mem isolation、Generation of iPSCs from Tn/mem、Generation of CAR-positive, clonal iPSC lines |
| PSC-ATO分化 | 各阶段培养基因子浓度、iMP与MS5-hDLL4细胞比例、iMO/ATO培养时间5–7周 阅读提示：Methods中Differentiation of Tn/mem-derived, CAR+ iPSC into CAR+ T cells by PSC-ATO culture及Figure 1A |
| REM扩增 | 饲养细胞数量与辐照剂量、anti-CD3/IL-2/IL-7浓度、14天扩增与换液频率 阅读提示：Methods中PSC-ATO分化小节末段与REM描述 |
| 体外功能实验 | 靶细胞CD19+与CD19KO配对、E:T比、4h/48h终点、复制孔数与统计方法 阅读提示：Methods中In vitro T cell functional assays及Figure 3图注 |
| 体内异种移植实验 | NSG小鼠周龄、NALM6接种量与途径、CAR T剂量与给药天数、NS0-hIL15剂量与频次、AZD5363浓度 阅读提示：Methods中Mice小节及Figure 4、Figure 5图注 |