构建DDX41突变小鼠模型并验证等位基因表达
模拟患者种系移码突变与获得性R525H突变。
构建Ddx41外显子7–9 floxed条件敲除小鼠和Ddx41R525H条件敲入小鼠，与Rosa26-CreERT2杂交；从Lin− BM细胞体外4-OH-他莫昔芬处理后验证cDNA序列和蛋白表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
种系DDX41突变导致无效造血和骨髓增生异常
Germline DDX41 mutations cause ineffective hematopoiesis and myelodysplasia.
实验完整度
高包含条件敲除与R525H敲入小鼠、骨髓移植、竞争移植、体外HPC集落与细胞周期/凋亡、RNA-seq、HyperTRIBE、CRISPR筛选、核糖体多聚体及患者样本测序
主要模型
Ddx41flox与Ddx41R525H条件敲入小鼠 小鼠MLL-AF9永生化Lin−白血病干/祖细胞（LSPC） 人AML细胞系THP1 MDS/AML患者骨髓样本
重点核对
他莫昔芬诱导：1 mg溶于50 μl玉米油，腹腔注射，连续5天，一周后重复 骨髓移植：尾静脉注射1×10^6 BMNC；竞争移植注射2×10^6 BM细胞（每株1×10^6） 体外Cre诱导：LSPC用1 μM 4-OH-他莫昔芬处理24小时，Lin− BM细胞处理48小时 80:20混合移植：8×10^5 Ddx41f/+;Rosa-Cre-ERT细胞与2×10^5 Ddx41f/KI;Rosa-Cre-ERT细胞 流式检测时间点：他莫昔芬后48或72小时检测Annexin V、EdU、TMRE、HPG
摘要
DDX41突变是成人骨髓增生异常综合征（MDS）中最常见的种系改变。大多数患者携带种系单等位基因移码DDX41突变，随后在其另一个DDX41等位基因上获得体细胞突变，通常为错义突变R525H。携带双等位基因移码和R525H突变的造血祖细胞（HPC）发生细胞周期阻滞和凋亡，导致小鼠骨髓衰竭。在机制上，DDX41对snoRNA加工、核糖体组装和蛋白质合成至关重要。尽管单等位基因DDX41突变在年轻小鼠中不影响造血，但一部分老龄小鼠会发展出MDS特征。在MDS患者骨髓（BM）的非优势造血干细胞克隆中，以低频率观察到DDX41双等位基因突变。嵌合有单等位基因DDX41突变BM细胞和少数双等位基因突变BM细胞的小鼠在更年轻时即出现造血缺陷，提示双等位基因DDX41突变细胞在单等位基因DDX41突变BM背景下具有疾病修饰作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DDX41突变如何影响造血干/祖细胞功能，以及单等位与双等位DDX41突变细胞如何共同参与MDS发病。
- 核心机制
- DDX41缺失导致snoRNA加工缺陷，成熟snoRNA减少，rRNA假尿苷化及rRNA加工受损，核糖体组装和蛋白质合成下降，使增殖性造血祖细胞发生细胞周期阻滞和凋亡。
- 主要证据
- 条件敲除与R525H敲入小鼠骨髓移植显示双等位突变导致骨髓衰竭，竞争移植显示单等位突变获竞争优势；RNA-seq、HyperTRIBE和qRT-PCR显示snoRNA加工异常；多聚体分析和HPG掺入显示翻译受损；80:20混合移植显示双等位突变小克隆加剧单等位突变骨髓的造血缺陷。
- 研究意义
- 研究提出单等位与双等位DDX41突变细胞共存参与DDX41突变患者的造血缺陷，并提示DDX41通过snoRNA加工和核糖体生物发生促进MDS发病。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
骨髓移植评估DDX41对造血重建的必要性
确定单等位和双等位Ddx41突变对造血重建的影响。
将野生型、单等位和双等位Ddx41突变BM细胞移植入致死照射受体，移植前或移植后给予他莫昔芬，监测生存、血计数、骨髓和脾病理。
体外评估HPC集落形成、增殖、细胞周期和凋亡
确定DDX41缺失对造血祖细胞功能的影响。
分离Lin− BM细胞，进行甲基纤维素集落形成、液相培养、细胞周期和Annexin V检测；并用MLL-AF9永生化LSPC及THP1 shDDX41细胞评估增殖和凋亡。
竞争性骨髓移植评估HSPC竞争能力
比较单等位和双等位Ddx41突变HSPC在体内的竞争能力。
将CD45.2+ Ddx41突变BM细胞与CD45.1+竞争BM细胞等量混合移植入致死照射CD45.1+受体，4周后他莫昔芬诱导，追踪16周外周血和骨髓嵌合率，并进行二次移植。
老龄小鼠评估单等位DDX41突变的年龄依赖造血缺陷
确定单等位Ddx41突变是否随年龄导致造血异常。
移植野生型、Ddx41+/−和Ddx41KI/+ BM细胞，移植前或移植后他莫昔芬诱导，观察15个月，检测血计数、骨髓细胞量、脾重量和组织病理。
RNA-seq和HyperTRIBE解析DDX41的RNA结合与snoRNA加工
确定DDX41缺失后的分子改变及DDX41结合的RNA类别。
对Ddx41+/+和Ddx41−/− LSPC进行RNA-seq；在THP1细胞表达DDX41-ADAR(CD)或ADAR(CD)对照，通过RNA-seq鉴定A-to-I编辑位点；qRT-PCR验证snoRNA及其宿主基因表达。
评估成熟snoRNA、rRNA假尿苷化、rRNA加工和蛋白质合成
确定snoRNA加工缺陷是否导致核糖体功能和翻译受损。
小RNA组分qRT-PCR和Northern blot检测成熟snoRNA；CMC-qPCR和引物延伸检测rRNA假尿苷化；Northern blot检测45S/19S/12S rRNA加工；HPG掺入和多聚体分析检测蛋白质合成与核糖体组装；shRNA敲低单个snoRNA验证功能。
全基因组CRISPR-Cas9筛选DDX41缺失细胞的存活通路
确定完全缺失Ddx41时促进细胞存活的基因和通路。
Ddx41f/f;Rosa-CreERT;Rosa-Cas9 Lin− BM细胞转导Brie sgRNA文库，他莫昔芬处理5天，测序鉴定富集sgRNA，MAGeCK分析。
80:20混合移植模拟双等位突变小克隆
模拟患者中低变异等位基因频率的双等位DDX41突变细胞对单等位突变骨髓的影响。
将80% Ddx41+/−与20% Ddx41KI/− BM细胞混合移植入致死照射CD45.1+受体，4周后他莫昔芬诱导，8周后检测血计数、骨髓和脾髓系比例、cleaved caspase和病理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
患者样本分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | 兔多克隆抗DDX41抗体 | Abcam | Ab210809 |
| 兔单克隆抗Vinculin抗体（E1E9V） | Cell Signaling Technology | AB_2728768 | |
| 兔多克隆Pan-Actin抗体 | Cell Signaling Technology | AB_2313904 | |
| 兔单克隆抗GAPDH抗体（D16H11） | Cell Signaling Technology | AB_10622025 | |
| 流式分析 | 抗B220 APC抗体 | eBioscience | AB_469395 |
| 抗CD11b PE-Cy7抗体 | eBioscience | AB_469587 | |
| 抗CD45.1 BV510抗体 | BioLegend | AB_2563378 | |
| 抗CD45.2 APC-eFluor780抗体 | eBioscience | AB_1272175 | |
| 抗CD48 FITC抗体 | eBiosceince | AB_465078 | |
| 抗CD117 APC抗体 | eBioscience | AB_469429 | |
| 抗CD150 PE-Cy7抗体 | BioLegend | AB_439797 | |
| 抗Ly-6G（Gr-1）eFluor 450抗体 | eBioscience | AB_1548788 | |
| 抗Ly-6A/E（Sca-1）PE抗体 | eBioscience | AB_466086 | |
| 链霉亲和素eFluor® 450 | eBioscience | AB_10359737 | |
| 小鼠造血谱系生物素抗体 Panel | eBioscience | AB_476399 | |
| 抗CD3e FITC抗体 | eBioscience | AB_464882 | |
| AnnexinV APC | eBioscience | AB_2575166 | |
| 细胞培养 | 小鼠Flt3配体细胞因子 | PeproTech | 250-31 |
| 小鼠IL-3细胞因子 | PeproTech | 213-13 | |
| 人IL-6细胞因子 | PeproTech | 200-06 | |
| 小鼠SCF细胞因子 | PeproTech | 250-03 | |
| 人TPO细胞因子 | PeproTech | -- | |
| 集落形成实验 | Methocult GF M3434培养基 | Stem Cell Technologies | 03434 |
| 细胞培养 | 无钙镁Dulbecco PBS | VWR | 45000-446 |
| 免疫沉淀 | A/G Protein PLUS琼脂糖 | Santa Cruz | sc-2003 |
| 细胞培养 | RPMI培养基 | Fisher | SH30027.01 |
| 蛋白质合成检测 | 无甲硫氨酸RPMI | ThermoFisher | A1451701 |
| 细胞培养 | IMDM培养基 | Corning | 10-016-CV |
| DMEM培养基 | Fisher | SH30022FS | |
| 转染 | TransIT-LT1转染试剂 | Mirus | MIR2306 |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11550 |
| 青霉素/链霉素 | ThermoFisher | SV30010 | |
| cDNA合成 | Superscript II逆转录酶 | ThermoFisher | 18064014 |
| RnaseOUT重组核糖核酸酶抑制剂 | ThermoFisher | 10777019 | |
| 假尿苷检测 | N-环己基-N′-(2-吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐（CMC） | ThermoFisher | C106402-1G |
| 氯化锰 | Sigma | M1787 | |
| Bicine缓冲液 | Sigma | B3876 | |
| 体内诱导 | 他莫昔芬 | Sigma | T-5648 |
| 体外诱导 | 4-羟基他莫昔芬 | Sigma | H-7904 |
| 细胞活力检测 | CellTiterGlo试剂盒 | Promega | G7570 |
| Lin−细胞富集 | 小鼠造血祖细胞富集试剂盒 | Stem Cell Technologies | 19856 |
| Northern blot | Pierce生物素3’端DNA标记试剂盒 | ThermoFisher | 89818 |
| RNA片段化 | NEBNext镁离子RNA片段化模块 | ThermoFIsher | E6150S |
| qPCR | POWRUP SYBR green预混液 | ThermoFisher | A25776 |
| 蛋白质合成检测 | Click-IT L-高炔丙基甘氨酸 | ThermoFisher | C10186 |
| Northern blot | NorthernMAX试剂盒 | ThermoFisher | AM1940 |
| 小RNA分离 | mirVana miRNA分离试剂盒 | ThermoFisher | AM1561 |
| 基因分型 | GeneAmp Fast PCR预混液2x | ThermoFisher | 4359187 |
| 流式分析 | Click-IT Edu Alexa Fluor 647 | ThermoFisher | C10424 |
| Northern blot检测 | 化学发光核酸检测模块试剂盒 | ThermoFisher | 89880 |
| RNA分离 | Zymo Quick-RNA小量制备试剂盒 | Zymo Research | R1050 |
| 细胞培养 | THP-1细胞 | ATCC | TIB-202 |
| 病毒包装 | HEK293T细胞 | ATCC | ATC CRL-3216 |
| 小鼠模型 | 小鼠：C57Bl/6N Ddx41tm1a | KOMP | MMRRC_047340-UCD |
| 小鼠：Rosa26-CreERT2 | Jackson | RRID:IMSR_JAX:008463 | |
| 小鼠：Rosa26-Cas9 | Jackson | RRID:IMSR_JAX:026179 | |
| 小鼠：Rosa26::Flpe | Jackson | RRID:IMSR_JAX:009086 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 他莫昔芬诱导与骨髓移植 | 他莫昔芬剂量1 mg/50 μl玉米油、腹腔注射连续5天并一周后重复；移植细胞数1×10^6 BMNC；竞争移植每株1×10^6；受体为致死照射CD45.1+雌性C57Bl/6 BoyJ小鼠 阅读提示：STAR Methods中Mice小节及图1E、图1I、图2A、图7E图注 |
| 体外Cre诱导与细胞功能检测 | LSPC用1 μM 4-OH-他莫昔芬处理24小时，Lin− BM细胞处理48小时；集落培养12天；细胞周期和Annexin V在他莫昔芬后72小时检测；每组n=3 阅读提示：STAR Methods中Cell lines、Colony assay、Flow cytometry小节及图1N–O、图5D–E图注 |
| snoRNA加工与假尿苷化检测 | RNA-seq取样为他莫昔芬后48小时；CMC浓度0.2 M、37°C 20分钟；qRT-PCR为3个独立生物学重复 阅读提示：STAR Methods中Pseudouridine analysis、RNA-Sequencing of mouse LSPC小节及图4D、图5A图注 |
| 蛋白质合成与多聚体分析 | HPG掺入n=3独立生物学重复；多聚体分析使用15–20M活细胞、环己酰亚胺100 μg/mL；LSPC处理48小时 阅读提示：STAR Methods中Polysome analysis小节及图6A–B图注 |
| 80:20混合移植模拟双等位小克隆 | 8×10^5 Ddx41f/+;Rosa-Cre-ERT与2×10^5 Ddx41f/KI;Rosa-Cre-ERT混合；移植后4周他莫昔芬；8周后检测血计数和cleaved caspase；图7H n=3独立小鼠 阅读提示：图7D–I图注及Results中“Ineffective hematopoiesis occurs in younger mice…”段落 |