CISH−/− iPSC的构建与验证
获得CISH敲除的人iPSC克隆并验证其多能性和核型。
利用CRISPR/Cas9和两条靶向CISH外显子3的gRNA敲除CISH，挑选单克隆，Sanger测序和TA克隆验证双等位基因移码突变，G显带核型分析。
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通过删除人iPSC衍生NK细胞中的CISH进行代谢重编程可促进体内持久性并增强抗肿瘤活性
Metabolic Reprograming via Deletion of CISH in Human iPSC-Derived NK Cells Promotes In Vivo Persistence and Enhances Anti-tumor Activity.
实验完整度
高包含体外细胞模型、小鼠异种移植模型及RNA-seq，并进行了功能与机制验证
主要模型
人iPSC衍生NK细胞（CISH−/−与WT） 白血病细胞系K562、MOLM-13及卵巢癌SKOV-3 NSG小鼠MOLM-13异种移植模型 人外周血来源原代NK细胞
重点核对
CISH−/− iPSC-NK细胞在低浓度IL-15（1 ng/ml）下培养3周后的扩增倍数与存活 CISH−/− iPSC-NK细胞在低浓度IL-15下对K562、MOLM-13、SKOV-3的短期（4小时）和长期（>20小时）细胞毒活性 NSG小鼠静脉接种5×10^6 MOLM-13细胞后次日注射1×10^7 NK细胞，每2天给予IL-2支持，监测肿瘤负荷与生存 CISH−/− iPSC-NK细胞中IL-15刺激后JAK1、STAT3、STAT5磷酸化及mTOR下游pS6、pS6K1水平 雷帕霉素（100 ng/ml）处理7天对CISH−/− iPSC-NK细胞糖酵解、线粒体呼吸及细胞毒功能的影响
摘要
细胞因子诱导的含SH2蛋白（CIS，由CISH基因编码）是自然杀伤（NK）细胞中IL-15信号的关键负调控因子。在此，我们利用诱导多能干细胞衍生的NK细胞（iPSC-NK细胞）平台开发了人CISH敲除（CISH−/−）NK细胞。CISH−/− iPSC-NK细胞表现出增加的IL-15介导的JAK-STAT信号活性。因此，当维持在低细胞因子浓度下时，CISH−/− iPSC-NK细胞表现出改善的扩增和对多种肿瘤细胞系的细胞毒活性增加。在白血病异种移植模型中，CISH−/− iPSC-NK细胞显示出显著增加的体内持久性和对肿瘤进展的抑制。机制上，CISH−/− iPSC-NK细胞表现出改善的代谢适应性，其特征是由mTOR信号介导的增加的基础糖酵解、糖酵解能力、最大线粒体呼吸、ATP关联呼吸和备用呼吸能力，这直接促进了NK细胞功能的增强。总之，这些研究表明CIS在调节人NK细胞代谢活动中起关键作用，从而调节抗肿瘤活性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 删除人NK细胞中的CISH能否通过改善代谢适应性增强其抗肿瘤活性和体内持久性。
- 核心机制
- CIS缺失增强IL-15介导的JAK-STAT信号，并通过mTOR信号改善NK细胞代谢适应性（糖酵解和氧化磷酸化），直接促进NK细胞功能。
- 主要证据
- CISH−/− iPSC-NK细胞在低IL-15下扩增和杀伤能力增强；在MOLM-13异种移植模型中肿瘤负荷降低、生存期延长、外周血持久性增加；RNA-seq和免疫印迹显示JAK-STAT及mTOR通路激活增强；雷帕霉素处理逆转代谢和功能增强。
- 研究意义
- 支持通过阻断细胞内免疫检查点CISH并改善代谢适应性来增强NK细胞介导的抗肿瘤活性，用于过继免疫治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CISH−/− iPSC-NK细胞的诱导分化与表型鉴定
从CISH−/− iPSC定向分化NK细胞并确认其表型成熟。
通过造血分化和NK细胞分化条件从iPSC生成NK细胞，用流式细胞术和质谱流式分析NK表面标志物。
低细胞因子条件下扩增与功能评估
验证CISH−/− iPSC-NK细胞在低IL-15/IL-2条件下的扩增和抗肿瘤功能。
在无细胞因子或低浓度IL-15（1 ng/ml）或低浓度IL-2（10 U/ml）下培养3周，检测扩增、细胞毒活性、CD107a脱颗粒和IFN-γ产生。
体内抗肿瘤与持久性验证
评估CISH−/− iPSC-NK细胞在白血病异种移植模型中的抗肿瘤活性和体内持久性。
NSG小鼠静脉接种 luciferase 表达的MOLM-13细胞，次日注射NK细胞，IL-2支持，生物发光成像监测肿瘤负荷，生存分析，流式检测外周血人CD56+细胞。
IL-15信号与代谢机制分析
揭示CISH缺失增强IL-15信号和代谢适应的分子机制。
RNA-seq分析差异基因和通路，免疫印迹检测JAK-STAT和mTOR通路磷酸化，Seahorse分析糖酵解和线粒体呼吸，雷帕霉素抑制mTORC1后评估代谢和功能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因编辑与克隆验证
评估代谢功能
评估体内抗肿瘤效果
单细胞多功能性分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Accutase细胞消化液 | STEMCELL Technologies | 07920 |
| 基质胶 | Corning | 354277 | |
| RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11875085 | |
| 基因编辑 | pSpCas9质粒 | GenScript | PX165 |
| pGS-gRNA质粒 | GenScript | -- | |
| Nucleofector 2b电转仪 | Lonza | AAB-1001 | |
| 人干细胞核转染试剂盒 | Lonza | VPH-5012 | |
| 嘌呤霉素 | Sigma | P8833 | |
| NK细胞分化 | STEMdiff APEL2培养基 | Stemcell Technologies | 05270 |
| 重组人SCF | R&D Systems | 255-SC/CF | |
| 重组人VEGF | R&D Systems | 293-VE | |
| 重组人BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
| ROCK抑制剂Y27632 | Sigma | -- | |
| 重组人IL-3 | Pepro Technology | 200-03 | |
| 重组人IL-15 | R&D Systems | 247-IL | |
| 重组人IL-7 | R&D Systems | 207-IL | |
| 重组人FLT-3配体 | Pepro Technology | 300-19 | |
| NK细胞扩增 | 重组人IL-2 | Proleukin | NDC-66483-116-07 |
| NK细胞分离 | EasySep人NK细胞富集试剂盒 | Stemcell Technologies | 19055 |
| 流式细胞术 | PE标记抗人CD107a抗体 | BD Biosciences | 555801 |
| APC标记抗人CD56抗体 | BD Biosciences | 555518 | |
| PE标记抗人CD45抗体 | BD Biosciences | 555483 | |
| Pacific Blue标记抗人IFN-γ抗体 | Biolegend | 502522 | |
| GolgiStop蛋白转运抑制剂 | BD Biosciences | 554724 | |
| GolgiPlug蛋白转运抑制剂 | BD Biosciences | 555029 | |
| 细胞毒性试验 | CellTrace Violet细胞增殖试剂盒 | Thermo Fisher | C34571 |
| CellEvent Caspase-3/7绿色检测试剂 | Thermo Fisher | C10423 | |
| SYTOX AADvanced死细胞染色液 | Thermo Fisher | S10349 | |
| CellTrace Far Red细胞增殖试剂盒 | Thermo Fisher | C34564 | |
| IncuCyte Caspase-3/7绿色凋亡检测试剂 | Essen Bioscience | 4440 | |
| 代谢分析 | Seahorse XF糖酵解速率检测试剂盒 | Agilent | 103344-100 |
| Seahorse XF细胞线粒体压力检测试剂盒 | Agilent | 103015-100 | |
| 雷帕霉素 | Sigma | R8781 | |
| 多聚-D-赖氨酸 | Sigma | P6407 | |
| 单细胞细胞因子分析 | 重组人IL-12 | R&D Systems | 219-IL-005 |
| 重组人IL-18 | R&D Systems | 9124-IL-010 | |
| 体内实验 | ACK裂解液 | Gibco | A10492 |
| 免疫印迹 | 兔单克隆抗CIS抗体(D4C10) | Cell Signaling Technology | 8431 |
| 鼠单克隆抗JAK1抗体(73/JAK1) | BD Biosciences | 610231 | |
| 兔单克隆抗磷酸化JAK1 (Y1022 + Y1023)抗体[EPR1899(2)] | Abcam | ab138005 | |
| 兔单克隆抗STAT3抗体(D3Z2G) | Cell Signaling Technology | 12640 | |
| 兔多克隆抗磷酸化STAT3 (Tyr705)抗体 | Cell Signaling Technology | 9131 | |
| 鼠单克隆抗STAT5抗体(251619) | R&D System | MAB2174 | |
| 兔单克隆抗磷酸化STAT5 (Tyr694)抗体(D47E7) | Cell Signaling Technology | 4322 | |
| 兔单克隆抗磷酸化p70 S6激酶(Thr389)抗体(D5U1O) | Cell Signaling Technology | 97596 | |
| 兔多克隆抗p70 S6激酶抗体 | Cell Signaling Technology | 9202 | |
| 兔单克隆抗磷酸化S6核糖体蛋白(Ser235/236)抗体(D57.2.2E) | Cell Signaling Technology | 4858 | |
| 兔单克隆抗S6核糖体蛋白抗体(5G10) | Cell Signaling Technology | 2217 | |
| 兔单克隆抗GAPDH抗体(D16H11) | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| 兔单克隆抗Vinculin抗体(E1E9V) | Cell Signaling Technology | 13901 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CISH−/− iPSC克隆构建 | gRNA序列、Cas9/gRNA转染量、嘌呤霉素筛选浓度与时间、单克隆挑选密度 阅读提示：STAR Methods中Generation, identification and karyotyping of clonal CISH−/− iPSC小节及Figure 1C |
| iPSC向NK细胞分化 | 初始iPSC接种数量、分化各阶段细胞因子浓度与时间、换液方式 阅读提示：STAR Methods中Derivation and expansion of NK cells from WT and CISH−/− iPSCs小节 |
| 低细胞因子条件下扩增与功能检测 | IL-15/IL-2浓度、培养时间、效靶比、刺激时间 阅读提示：Results中CISH−/− iPSC-NK cells display better expansion and function...小节及Figure 3图注 |
| 体内异种移植实验 | 小鼠品系与数量、肿瘤细胞接种量、NK细胞注射量与时间、IL-2给药方案、监测终点 阅读提示：STAR Methods中In vivo xenograft studies小节及Figure 4图注 |
| 代谢分析 | 细胞接种密度、Seahorse试剂盒、抑制剂浓度、雷帕霉素处理浓度与时间 阅读提示：STAR Methods中Metabolic studies小节及Figure 6、7图注 |