建立双荧光报告小鼠及三维组织透明化成像
在三维水平可视化并定量MuSCs与毛细血管ECs的空间关系。
将Pax7CreERT2:R26RtdT（标记MuSCs）与Flk1GFP（标记ECs）小鼠杂交，经TMX诱导后取肌肉组织进行透明化处理，使用共聚焦/双光子显微镜成像，并进行图像分割和距离测量。
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肌肉卫星细胞与血管龛的相互作用通过VEGF和Notch信号维持静息状态
Muscle Satellite Cell Cross-Talk with a Vascular Niche Maintains Quiescence via VEGF and Notch Signaling.
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内基因敲除/过表达小鼠模型、三维成像定量和转录组分析，并进行了功能与机制验证
主要模型
Pax7tdT:Flk1GFP双报告小鼠 MuSC特异性VEGFA敲除小鼠 VEGFAHyper过表达小鼠 MuSC与B.end3 EC共培养体系
重点核对
MuSC特异性VEGFA敲除后MuSC与毛细血管距离增加，且损伤后MuSC数量减少 VEGFAHyper供体成肌细胞移植后MuSC与毛细血管距离减小 EdU+标记保留细胞（LRCs）优先靠近毛细血管分布 EC共培养通过Dll4-Notch促进Pax7+MyoD−储备细胞形成，DAPT或Dll4敲低可减弱此效应
摘要
骨骼肌是一个复杂组织，包含组织驻留的肌肉干细胞（卫星细胞，MuSCs），对出生后肌肉生长和再生至关重要。目前缺乏对MuSCs潜在血管周龛的定量分析、生物学功能及分子通路的研究。我们利用荧光报告小鼠和肌肉组织透明化技术，在三维空间中研究MuSCs与毛细血管的邻近关系。我们发现MuSCs表达丰富的VEGFA，在体外可招募内皮细胞（ECs），而使用VEGF抑制剂阻断VEGFA以及MuSC特异性VEGFA基因缺失均会降低MuSCs与毛细血管的邻近程度。重要的是，这种与血管的邻近关系与MuSC自我更新相关，其中EC来源的Notch配体Dll4诱导MuSCs静息。我们假设MuSCs通过VEGFA招募毛细血管ECs，作为回报，ECs通过Dll4维持MuSC静息。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 骨骼肌中MuSCs与内皮细胞之间的空间关系、分子互作机制及其对MuSC静息维持的功能后果尚不清楚，本研究旨在探究MuSCs与毛细血管ECs的相互作用及其调控MuSC自我更新的机制。
- 核心机制
- MuSCs分泌VEGFA招募毛细血管ECs，建立血管周龛；ECs表达的Notch配体Dll4与MuSCs上的Notch受体结合，诱导并维持MuSC静息状态。
- 主要证据
- 通过组织透明化三维成像发现MuSCs靠近毛细血管；RNA-seq和方向性相互作用组分析富集到VEGF和Notch通路；VEGFA敲除/阻断及过表达实验改变MuSC与血管距离和MuSC数量；共培养实验表明EC来源Dll4通过Notch促进储备细胞形成。
- 研究意义
- 揭示了MuSCs与血管内皮细胞之间的双向信号交流是维持MuSC静息和自我更新的重要龛机制，为理解干细胞与血管龛的相互作用提供了依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
定量MuSCs与毛细血管的邻近分布
比较不同肌肉类型中MuSCs与毛细血管的距离分布差异。
对EOM、比目鱼肌和TA肌肉透明化成像，计算MuSCs到最近毛细血管的距离。
筛选MuSCs与ECs间的配体-受体互作
鉴定介导MuSCs与ECs相互作用的候选信号通路。
对新鲜分离的MuSCs、ECs和单肌纤维进行RNA-seq，基于配体-受体数据库进行方向性相互作用组分析和GO富集分析。
验证MuSC来源VEGFA对EC招募和血管邻近性的作用
确定MuSC来源VEGFA是否介导ECs的趋化和MuSC-血管邻近。
Transwell趋化实验检测成肌细胞来源VEGFA对EC迁移的影响；使用Flt1-FC阻断VEGFA；MuSC特异性VEGFA敲除小鼠和VEGFAHyper过表达小鼠移植实验，结合三维成像测量距离。
检测MuSCs邻近血管与静息状态的关系
探究靠近毛细血管的MuSCs是否富集静息标记保留细胞（LRCs）。
新生小鼠EdU脉冲标记，追踪LRCs，结合组织透明化成像分析EdU+ MuSCs与毛细血管的距离分布。
验证EC来源Dll4-Notch信号对MuSC静息/自我更新的作用
确定ECs是否通过Dll4-Notch信号诱导MuSC静息和储备细胞形成。
MuSCs与B.end3 EC或10T1/2细胞共培养，检测Pax7+MyoD−储备细胞形成；使用DAPT抑制Notch信号或siRNA敲低Dll4、Dll1、Jag1、Jag2；检测VEGFA敲除后MuSCs中Notch下游基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 碱性成纤维细胞生长因子 | ThermoFisher Scientific | PHG0263 |
| 4-羟基他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | H6278 | |
| 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | ThermoFisher Scientific | 11668019 | |
| Notch信号抑制 | DAPT（γ-分泌酶抑制剂） | Sigma-Aldrich | D5942 |
| 单肌纤维分离 | I型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C0130 |
| 单肌纤维培养 | 鸡胚提取物 | MP Biomedicals | 092850145 |
| 免疫染色 | 抗Pecam1（CD31）抗体 | BD Biosciences | 551262 |
| 番茄凝集素 | Vector labs | DL-1178 | |
| 流式细胞术 | ZombieNIR活性染料 | Biolegend | 423105 |
| EdU检测 | Click-iT EdU Alexa Fluor 647成像试剂盒 | Baseclick | BCK-EdU647 |
| Transwell迁移实验 | Transwell小室（8 μm） | Corning | 3422 |
| VEGFA阻断 | Flt1-FC重组蛋白 | R&D Systems | 321-FL-050 |
| Transwell迁移实验 | 重组VEGFA蛋白 | R&D Systems | 493-MV-025 |
| Transwell染色 | 结晶紫 | Sigma-Aldrich | HT90132 |
| 肌肉损伤 | 心脏毒素 | Sigma-Aldrich | 217503 |
| 氯化钡 | Sigma-Aldrich | 342920 | |
| ELISA | 小鼠VEGF Duoset ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY493 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | ThermoFisher Scientific | 15596026 |
| Direct-zol RNA微量制备试剂盒 | Zymo Research | R2062 | |
| cDNA合成 | Transcriptor第一链cDNA合成试剂盒 | Roche Molecular Diagnostics | 04379012001 |
| qPCR | GoTaq qPCR预混液 | Promega | A6001 |
| RNA定量 | Quant-iT RiboGreen RNA检测试剂盒 | ThermoFisher Scientific | R11490 |
| RNA-seq文库构建 | SMARTer链特异性总RNA-Seq-Pico哺乳动物试剂盒 | Clontech | 635007 |
| 组织透明化 | 甘氨酸 | Sigma-Aldrich | G7126 |
| 乙酰胺 | Sigma-Aldrich | A0500 | |
| VA-044热引发剂 | Wako Chemical | NC0632395 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | L6026 | |
| 硼酸 | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Histodenz | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| N-甲基-D-葡糖胺 | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| 泛影酸 | Sigma-Aldrich | D9268 | |
| 碘克沙醇 | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| 样品包埋 | 低熔点琼脂糖 | ThermoFisher Scientific | 16520050 |
| 成像校准 | 荧光微球（1 μm） | ThermoFisher Scientific | R0100B |
| siRNA转染 | Dll1 siRNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-39668 |
| Dll4 siRNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-37201 | |
| Jag1 siRNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-37203 | |
| Jag2 siRNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-39673 | |
| 对照scramble siRNA-A | Santa Cruz Biotechnology | sc-37007 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MuSC与EC邻近性三维成像 | TMX诱导方案（75 mg/kg BW，5天内3次，追迹5天）、组织透明化流程、成像参数（50 μm厚度MIP） 阅读提示：Methods 'Injection of tamoxifen (TMX) or Flt1-FC'、'Tissue clearing'、'Imaging'小节及Figure 1和2图注 |
| VEGFA敲除与过表达体内实验 | MuSC特异性VEGFA敲除的TMX诱导时间（8周龄）、分析时间点（21天后）、VEGFAHyper供体细胞移植数量（5×10^5）和损伤模型（BaCl2 1%） 阅读提示：Methods 'Injection of tamoxifen (TMX) or Flt1-FC'、'Cell transplantation'小节及Figure 4图注 |
| EdU标记保留细胞（LRCs）实验 | EdU剂量（50 μg/g BW，24小时内4次）、4-OHT剂量（80 mg/kg BW）、检测时间点（p7至p60） 阅读提示：Methods 'Label retaining cells (LRCs)'小节及Figure 5图注 |
| EC-MuSC共培养与储备细胞形成 | EC细胞系（B.end3）或10T1/2细胞、共培养比例与顺序、分化培养基（5%马血清DMEM）、DAPT浓度（10 μM）、siRNA转染试剂与浓度 阅读提示：Methods 'Co-culture'小节及Figure 7图注 |
| Transwell趋化实验 | Transwell孔径（8 μm）、迁移时间（3-4小时）、Flt1-FC浓度（50 ng/ml）、重组VEGFA浓度（50 ng/ml）、血清浓度（2% FBS） 阅读提示：Methods 'Cell chemotaxis assay'小节及Figure 4A图注 |