建立代谢综合征相关胃贲门腺癌小鼠模型
模拟代谢综合征条件下胃贲门腺癌的进展。
K19-Wnt1/C2mE小鼠从6周龄起喂食对照饮食或高脂饮食，联合或不联合腹腔注射PPAR-δ激动剂GW或拮抗剂GSK，至20周龄评估肿瘤。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
铁死亡调控肥胖相关胃癌中代谢性炎症驱动的肿瘤发生
Ferroptosis Regulates Metabolic Inflammation-Driven Tumorigenesis in Obesity-Related Gastric Cancer
实验完整度
高包含K19-Wnt1/C2mE与Nrf2-KO小鼠模型、AGS细胞体外实验、患者样本免疫组化，并有功能与机制验证
主要模型
K19-Wnt1/C2mE小鼠 Nrf2-KO K19-Wnt1/C2mE小鼠 AGS细胞 胃贲门腺癌患者组织样本
重点核对
K19-Wnt1/C2mE小鼠6-20周龄喂食对照或高脂饮食，腹腔注射GW（60 μg/次，每周两次）或GSK（150 μg/次，每周两次） Nrf2-KO K19-Wnt1/C2mE小鼠分组：对照、HFD+GSK、HFD+GSK+Fer-1（60 μg/次，每周两次，第12-18周） AGS细胞处理：GW 1 μM、GSK 20 μM或瘦素80 ng/mL处理24小时；erastin2 100 μM处理24小时；L-sulforaphane 10 μM预处理30分钟 siRNA转染：PPARD siRNA或NRF2 siRNA转染AGS细胞72小时，qPCR确认敲低效率 肿瘤面积比、肿瘤高度、HOMA-IR、血清瘦素、NQO1/GPx4/MDA/GSSG/GSH等检测终点
摘要
背景与目的：随着代谢综合征患病率增加，胃贲门腺癌发病率上升。过氧化物酶体增殖物激活受体-δ成为代谢综合征和癌变的关键靶点。我们旨在阐明其在胃贲门腺癌进展中的作用。方法：雄性角蛋白19启动子-Wnt1/环氧合酶-2和微粒体前列腺素E合酶-1过表达小鼠被喂食对照或高脂饮食，联合或不联合过氧化物酶体增殖物激活受体-δ激动剂GW-501516或拮抗剂GSK-3787。通过比较野生型和核因子红细胞2相关因子2缺陷条件，检查Nrf2在过氧化物酶体增殖物激活受体-δ调控的代谢驱动肿瘤发生中的作用。结果：在高脂饮食+GSK-3787治疗的伴有代谢性内毒素血症的角蛋白19启动子-Wnt1/环氧合酶-2和微粒体前列腺素E合酶-1过表达小鼠中，鳞柱交界处的颗粒-结节状肿瘤大于其他组。肿瘤内NAD(P)H醌脱氢酶1和谷胱甘肽过氧化物酶4蛋白表达增加，血浆中与肿瘤能量代谢相关的菌群失调相关代谢物水平增加。在高脂饮食+GSK-3787治疗的核因子红细胞2相关因子2缺陷小鼠中，肿瘤缩小，NAD(P)H醌脱氢酶1和谷胱甘肽过氧化物酶4蛋白表达降低，丙二醛水平和氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽比值增加，血浆中能量代谢和铁死亡抵抗相关代谢物水平降低。在GSK-3787或小干扰RNA处理的AGS细胞中抑制过氧化物酶体增殖物激活受体-δ信号，通过增加溶质载体家族7成员11表达和激活核因子红细胞2相关因子2信号抑制铁死亡。转染核因子红细胞2相关因子2小干扰RNA降低了GSK-3787诱导的溶质载体家族7成员11上调，且核因子红细胞2相关因子2通过结合其启动子直接调控SLC7A11转录。结论：高脂饮食和GSK-3787联合治疗可能通过抑制肿瘤内核因子红细胞2相关因子2信号和菌群失调相关代谢物来抑制铁死亡，从而促进鳞柱交界肿瘤进展，表明过氧化物酶体增殖物激活受体-δ信号在代谢综合征相关鳞柱交界肿瘤发生中起负面作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PPAR-δ信号在代谢综合征条件下如何促进胃贲门腺癌进展，以及NRF2调控的铁死亡是否参与其中。
- 核心机制
- 高脂饮食联合PPAR-δ拮抗剂GSK-3787通过抑制肿瘤内NRF2信号，上调SLC7A11和GPx4表达，抑制铁死亡，同时菌群失调相关代谢物和瘦素参与促进肿瘤进展。
- 主要证据
- HFD+GSK处理的K19-Wnt1/C2mE小鼠SCJ肿瘤增大，NQO1和GPx4表达增加，MDA降低；Nrf2-KO小鼠中肿瘤缩小，铁死亡标志物反向变化，Fer-1可逆转；AGS细胞中GSK通过NRF2上调SLC7A11抑制铁死亡，ChIP证实NRF2结合SLC7A11启动子。
- 研究意义
- 揭示PPAR-δ信号在代谢驱动胃贲门腺癌进展中的作用，为开发代谢综合征相关SCJ肿瘤的新型诊疗策略提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估全身代谢和肠道屏障功能
验证HFD+GSK是否诱导胰岛素抵抗、高瘦素血症和肠道菌群失调。
测量体重、内脏脂肪体积、HOMA-IR、血清瘦素；H&E和免疫组化检测回肠黏膜MUC2和ZO-1；16S rRNA测序分析盲肠内容物菌群；血浆代谢组学分析。
评估SCJ肿瘤生长和肿瘤免疫微环境
明确HFD+GSK对SCJ肿瘤生长和免疫细胞浸润的影响。
测量肿瘤面积比和肿瘤高度；免疫组化检测Ki67、8-OHdG、IFN-γ、CD4、CD8、PD-1、Iba-1、CD68、CD206阳性细胞；qPCR检测Ifng、Cxcl9、Ccl20 mRNA。
验证PPAR-δ/NRF2/铁死亡轴在AGS细胞中的作用
在体外验证PPAR-δ抑制是否通过NRF2调控SLC7A11和铁死亡。
AGS细胞转染PPARD siRNA或NRF2 siRNA，GSK处理，检测NRF2和SLC7A11表达；FerroOrange检测Fe2+；BODIPY 581/591 C11检测脂质过氧化；GSH/GSSG检测；ARE荧光素酶报告基因和ChIP-qPCR验证NRF2结合SLC7A11启动子。
通过Nrf2-KO小鼠验证NRF2在铁死亡调控中的作用
在体内验证Nrf2缺失是否通过促进铁死亡抑制HFD+GSK诱导的肿瘤生长。
Nrf2-KO K19-Wnt1/C2mE小鼠分为对照、HFD+GSK、HFD+GSK+Fer-1组，20周龄评估肿瘤；检测NQO1、GPx4、MDA、GSSG/GSH；免疫组化检测Ki67、8-OHdG、免疫细胞标志物。
分析临床GCA样本中NRF2与SLC7A11表达相关性
验证NRF2和SLC7A11在代谢综合征相关GCA患者肿瘤中的表达关系。
对25例GCA患者（MetS 13例，非MetS 12例）肿瘤组织进行NRF2和SLC7A11免疫组化染色，计算IRS评分，进行Spearman相关性分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | GW-501516 | Cayman Chemical | -- |
| GSK-3787 | Cayman Chemical | -- | |
| 细胞培养 | 重组人瘦素 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 120-06591 |
| erastin2 | Cayman Chemical | 27087 | |
| 动物实验 | ferrostatin-1 | Cayman Chemical | 17729 |
| 细胞培养 | L-萝卜硫素 | LKT Laboratories, Inc. | SC-203099D |
| Lipofectamine 3000试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Western blot | M-PER哺乳动物蛋白提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| NE-PER核质分离提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| NuPAGE Bis-Tris凝胶 | Invitrogen | -- | |
| Immobilon-P膜 | Millipore | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫组化 | Vectastain Elite ABC试剂盒 | Vector Laboratories | -- |
| 抗原修复液 | Agilent | -- | |
| RNA提取 | RNeasy微量RNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| TRIzol试剂 | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RT-qPCR | SuperScript VILO cDNA合成试剂盒 | Invitrogen | -- |
| TaqMan Fast Advanced预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| QuantStudio 3实时PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ARE荧光素酶实验 | ARE报告基因试剂盒（Nrf2抗氧化通路） | BPS Bioscience | -- |
| 两步法荧光素酶检测系统 | BPS Bioscience | -- | |
| Centro LB960发光检测仪 | Berthold Technologies | -- | |
| ChIP | ChIP-IT Express试剂盒 | Active Motif | -- |
| 染色质免疫沉淀DNA纯化试剂盒 | Active Motif | -- | |
| ChIP-qPCR | PowerTrack SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | -- |
| MTS实验 | CellTiter 96 AQueous One溶液 | Promega | -- |
| SpectraMax M2e酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| ROS检测 | 2',7'-二氯荧光素二乙酸酯细胞ROS检测试剂盒 | Abcam | -- |
| 铁离子检测 | FerroOrange试剂盒 | Dojindo | -- |
| BZ-X810荧光显微镜 | Keyence | -- | |
| MDA检测 | MDA检测试剂盒 | Dojindo | -- |
| 脂质过氧化检测 | BODIPY 581/591 C11 | Dojindo | -- |
| 血糖检测 | LabAssay葡萄糖试剂盒 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | -- |
| 胰岛素检测 | 超敏胰岛素ELISA试剂盒 | Morinaga Institute of Biological Science | -- |
| 瘦素检测 | 小鼠-大鼠瘦素检测试剂盒 | Morinaga BioScience, Inc | -- |
| 16S rRNA测序 | DNeasy PowerSoil Pro试剂盒 | Qiagen | -- |
| Illumina MiSeq测序平台 | Illumina, Inc | -- | |
| 代谢组学 | H3304-1002内标 | Human Metabolome Technologies, Inc | H3304-1002 |
| ULTRAFREE MCPLHCC 5-kDa截留滤器 | HMT | -- | |
| Agilent 7100毛细管电泳系统 | Agilent Technologies, Inc | -- | |
| Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific Inc | -- | |
| Agilent 1260等度HPLC泵 | Agilent Technologies, Inc | -- | |
| Agilent G1603A CE-MS适配器试剂盒 | Agilent Technologies, Inc | G1603A | |
| Agilent G1607A CE-ESI-MS喷雾器试剂盒 | Agilent Technologies, Inc | G1607A | |
| H3301-1001电泳缓冲液 | HMT | H3301-1001 | |
| I3302-1023电泳缓冲液 | HMT | I3302-1023 | |
| 免疫组化 | 抗CD4抗体 | Proteintech | 67786-1-Ig |
| 抗CD68抗体 | Abcam | ab955 | |
| 抗CD8-α抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7970 | |
| 抗c-Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 18583S | |
| 抗cyclinD1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-450 | |
| Western blot | 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 2118S |
| 抗GPx4抗体 | Abcam | ab125066 | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 4494S | |
| 免疫组化 | 抗Iba-1抗体 | Cell Signaling Technology | 17198T |
| 抗IFN-γ抗体 | Cell Signaling Technology | 98139S | |
| Western blot | 抗keap1抗体 | Proteintech | 60027-1-Ig |
| 免疫组化 | 抗Ki67抗体 | Abcam | ab190085 |
| Western blot | 抗NQO1抗体 | Abcam | ab28947 |
| 抗Nrf2抗体 | Abcam | ab31163 | |
| ChIP | 抗Nrf2抗体 | Abcam | ab137550 |
| 免疫组化 | 抗PD-1抗体 | Cell Signaling Technology | 84651T |
| Western blot | 抗p-STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 9145S |
| 抗SLC7A11抗体 | Abcam | ab307601 | |
| 抗STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 12640S | |
| 免疫组化/Western blot | 抗ZO-1抗体 | Abcam | ab190085 |
| Western blot | 抗β-actin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 |
| 抗β-catenin抗体 | Cell Signaling Technology | 9562S | |
| 免疫组化 | 抗8-OHdG抗体 | Japan Institute for the Control of Aging | MOG-020P |
| siRNA转染 | Silencer Select PPARD siRNA | Ambion, Invitrogen | s10884 |
| Silencer Select NRF2L2 siRNA | Ambion, Invitrogen | s9493 | |
| Silencer Select阴性对照siRNA | Ambion, Invitrogen | 4390843 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型与分组 | 小鼠品系（K19-Wnt1/C2mE、Nrf2-KO K19-Wnt1/C2mE）、性别（雄性）、周龄（6-20周）、每组样本量（n=3-9）、饲养条件（SPF） 阅读提示：Materials and Methods中Animal Models小节及Figure 1A、Figure 16A |
| 药物处理 | GW剂量60 μg/次、GSK剂量150 μg/次、Fer-1剂量60 μg/次、给药途径（腹腔注射）、频率（每周两次）、Fer-1给药时间窗（第12-18周） 阅读提示：Materials and Methods中Animal Models小节末段 |
| 细胞培养与处理 | AGS细胞来源（ATCC）、培养基（DMEM/F12+10% FBS+青霉素/链霉素）、GW 1 μM、GSK 20 μM、瘦素80 ng/mL、erastin2 100 μM、L-sulforaphane 10 μM、处理时间（24小时） 阅读提示：Materials and Methods中Cell Culture小节 |
| siRNA转染 | siRNA序列/货号（PPARD s10884、NRF2L2 s9493、对照4390843）、转染试剂（Lipofectamine 3000）、细胞接种密度（20,000细胞/孔，6孔板）、转染时间（72小时） 阅读提示：Materials and Methods中Small Interfering RNA Transfection小节 |
| 临床样本免疫组化 | 患者数量（25例）、MetS定义（ATP III标准+BMI≥25）、NRF2和SLC7A11抗体货号及稀释比、IRS评分方法 阅读提示：Materials and Methods中Immunohistochemical Staining of Tissues From Clinical Patients小节及Table 2 |