临床队列样本采集与TCR测序
探究BPd治疗应答相关的适应性免疫机制及γδ T细胞动态。
对Algonquin临床试验中多发性骨髓瘤患者（n=37）的PBMC和血浆cfDNA进行CapTCR-seq，并在基线、C2D1等时间点采集样本；对部分患者骨髓进行scCITE+VDJ-seq。
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从多发性骨髓瘤中鉴定广泛肿瘤反应性γδ TCR
Identification of broadly tumour-reactive γδ TCRs from multiple myeloma
实验完整度
高包含患者样本单细胞测序、体外TCR功能筛选、机器学习建模及抗原表位验证多个证据层级，并有功能与机制验证
主要模型
多发性骨髓瘤患者骨髓样本 NUR77-GFP Jurkat-76报告细胞系 多发性骨髓瘤细胞系（RPMI-8226、MM1R、AMO1等） 健康供者原代T细胞
重点核对
γδ TCR肿瘤反应性判定阈值：激活强度≥15%为TR，13-15%为临界，0-13%为NTR Jurkat报告细胞与MM细胞系共培养16-18小时，流式检测GFP+细胞比例 PreGame预测阈值≥0.85用于定义TR γδ TCR TCR65识别HLA-C及V103L表位，KIR3DL1与Bw4配体作为抑制性逻辑门 BPd临床试验中cfDNA δ TCR丰度从基线至C2D1的变化与PFS关联
摘要
γδ T细胞因其抗肿瘤能力和在介导免疫检查点阻断反应中的作用而日益受到重视。与经典αβ T细胞不同，γδ T细胞在诱导抗肿瘤反应中对T细胞受体（TCR）的依赖程度仍不清楚。区分具有肿瘤反应性TCR的γδ T细胞与旁观者γδ T细胞的困难，限制了对肿瘤反应性γδ T细胞生物学的理解及其TCR向免疫治疗转化的进程。在此，我们提出PreGame，一种能够从单细胞CITE测序数据中识别肿瘤反应性γδ T细胞的机器学习算法。我们利用PreGame从多发性骨髓瘤或其他实体瘤患者中鉴定肿瘤反应性γδ T细胞，并确认其TCR对肿瘤细胞的特异性。在临床上，我们证明肿瘤反应性γδ T细胞的扩增是接受belantamab mafodotin联合治疗的多发性骨髓瘤患者应答的早期生物标志物。我们还鉴定了普遍表达的HLA-C蛋白中的一个γδ TCR表位以及一个实现肿瘤免疫监视的逻辑门。因此，PreGame是一种多功能工具，可加速我们对γδ T细胞生物学的理解，并促进γδ TCR向通用疗法的转化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肿瘤浸润γδ T细胞是否通过其TCR直接识别肿瘤细胞，以及能否据此鉴定肿瘤反应性γδ TCR并转化为治疗工具。
- 核心机制
- 肿瘤反应性γδ T细胞通过γδ TCR直接识别肿瘤细胞上广泛表达的抗原（如HLA-C），其激活依赖TCR信号，并受KIR3DL1-Bw4抑制性逻辑门调控以区分肿瘤与健康细胞。
- 主要证据
- PreGame从单细胞CITE测序数据中识别TR γδ T细胞，体外Jurkat报告细胞和原代T细胞杀伤实验验证TCR肿瘤反应性；BPd临床试验中 responders 的TR γδ T细胞克隆扩增及cfDNA δ TCR丰度升高与PFS改善相关；TCR65识别HLA-C的L103表位。
- 研究意义
- PreGame可加速γδ T细胞生物学研究并促进γδ TCR向通用治疗转化；TR γδ T细胞扩增及cfDNA δ TCR动态可作为ADC联合治疗应答的早期生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞多组学注释γδ T细胞亚群
鉴定骨髓中γδ T细胞转录亚群及其与治疗应答的关系。
对骨髓样本进行scCITE+VDJ-seq，整合转录组、表面蛋白和免疫受体测序数据，注释αβ T、γδ T和NK细胞亚群，定义GZMB+和GZMK+ γδ T细胞簇。
体外筛选γδ TCR肿瘤反应性
验证从患者中鉴定出的γδ TCR是否识别MM肿瘤细胞。
将γδ TCR表达于NUR77-GFP Jurkat-76报告细胞，与MM细胞系或患者原代MM细胞共培养，流式检测GFP+细胞比例以计算激活强度。
PreGame机器学习模型训练与验证
建立从单细胞CITE测序数据预测肿瘤反应性γδ TCR的算法。
以体外验证的88个TR和361个NTR γδ T细胞为训练集，提取19基因签名、5蛋白签名及细胞周期特征，训练随机森林分类器，并在独立验证队列中评估。
原代γδ T细胞功能验证
确认TR γδ T细胞的肿瘤杀伤依赖TCR信号。
从MM患者骨髓分选GPR56+CD94+（TR富集）和GPR56-CD94-（NTR富集）γδ T细胞，与MM细胞共培养，检测4-1BB上调和CD138+肿瘤细胞凋亡，并加入抗γδ TCR阻断抗体。
γδ TCR抗原鉴定
确定TR γδ TCR识别的抗原及调控逻辑门。
利用CRISPR敲除B2M、BTN3A、HLA-A、HLA-C或HLA-ABC的MM细胞系，以及表达单HLA等位基因的人工抗原提呈细胞，测试TCR65反应性；构建HLA-C*03:04突变体定位表位；过表达KIR3DL1和CD8a测试Bw4抑制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | IMDM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| Ficoll分离液 | Sigma | -- | |
| 流式分析 | CD3抗体（OKT3克隆） | BioLegend | 317308 |
| B2M抗体（A17082A克隆） | BioLegend | 395716 | |
| CD69抗体（FN50克隆） | BioLegend | 310910 | |
| γδTCR抗体（B1克隆） | BioLegend | 331210 | |
| HLA-C抗体（DT-9克隆） | BD | 566372 | |
| KIR3DL1抗体（DX9克隆） | BioLegend | 312707 | |
| GPR56抗体（CG4克隆） | BioLegend | 358205 | |
| CD94抗体（HP-3D9克隆） | Invitrogen | 17-5094-4210 | |
| 4-1BB抗体（4B4克隆） | BioLegend | 309809 | |
| 单细胞测序 | TotalSeq-C人抗体混合物1.0 | BioLegend | -- |
| 10x Genomics Chromium 5′试剂盒V2 | 10x Genomics | -- | |
| TCR筛选 | Amaxa 4D核转染仪 | Lonza | -- |
| 嘌呤霉素 | Invivogen | -- | |
| HMBPP | Sigma | -- | |
| T细胞扩增 | 白介素-2 | BioLegend | -- |
| 白介素-15 | BioLegend | -- | |
| 植物血凝素-L | eBioscience | -- | |
| 细胞毒性实验 | Steady-Glo荧光素酶检测试剂盒 | Promega | -- |
| T细胞分选 | CD271磁珠 | Miltenyi Biotec | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| Jurkat报告细胞TCR筛选 | TR判定阈值：激活强度≥15%；临界13-15%；NTR 0-13%；共培养时间16-18小时；MM细胞系需过表达CD1D 阅读提示：Methods 'Jurkat cell-based γδ TCR screening'及Figure 2b图注 |
| PreGame训练与验证 | 训练集88 TR/361 NTR细胞；验证队列1 n=6、队列2 n=8；随机森林模型；阈值≥0.85；十折交叉验证重复100次 阅读提示：Methods 'PreGame development'及Figure 3图注 |
| 原代γδ T细胞杀伤实验 | 分选GPR56+CD94+与双阴性群体；抗γδ TCR阻断抗体B1 10 μg/ml；对照MOPC-21；患者n=5 阅读提示：Methods 'TR γδ T cell expansion from patient BM'及Figure 4g,h图注 |
| TCR65抗原表位鉴定 | HLA-C*03:04突变体G1C、V103L、K173E；KIR3DL1抗体DX9 10 μg/ml；HMBPP 1 μM；共培养过夜 阅读提示：Methods 'γδ TCR ligand identification'及Figure 6、Extended Data Fig. 9图注 |
| 临床队列生存分析 | 患者n=37（CapTCR-seq可用n=31用于PFS分析）；δ TCR丰度从基线至C2D1变化；中位数分层；Gehan-Breslow-Wilcoxon检验 阅读提示：Methods 'Patient survival analysis'及Figure 1b图注 |