低温对蛋白酶体活性的影响
确定低温是否选择性地影响蛋白酶体活性
将C. elegans成虫或HEK293细胞置于低温（15 °C或36 °C）处理，检测三种蛋白酶体活性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
低温通过PA28γ诱导的蛋白酶体延长寿命并防止疾病相关蛋白聚集
Cold temperature extends longevity and prevents disease-related protein aggregation through PA28γ-induced proteasomes
实验完整度
高包含C. elegans遗传模型、人类细胞系和iPSC衍生运动神经元等多种独立模型，涵盖功能验证（寿命、运动、凋亡）和机制验证（蛋白酶体活性、基因敲低/过表达、TRPA1/NHR-49通路）。
主要模型
秀丽隐杆线虫（野生型N2、fer-15;fem-1不育株） HEK293人胚胎肾细胞 肌萎缩侧索硬化患者iPSC衍生运动神经元（FUSP525L突变）
重点核对
低温处理温度（15 °C vs 20 °C vs 25 °C；人类36 °C vs 37 °C） psme-3/PSME3基因敲低或过表达 TRPA1基因敲低或HC-030031抑制 C. elegans寿命测定（n=96/组，20 °C发育后转移至15/20/25 °C） 胰蛋白酶样蛋白酶体活性测定
摘要
衰老是涉及蛋白质聚集的神经退行性疾病的主要风险因素。由于降低体温是延长变温动物和恒温动物寿命的最有效机制之一，更好地理解寒冷诱导的变化可以导致病理性蛋白聚集的趋同调节因子。在这里，我们发现在秀丽隐杆线虫中，低温（15 °C）通过PSME-3（人类PA28γ/PSME3的蠕虫直系同源物）选择性诱导蛋白酶体的胰蛋白酶样活性。这种蛋白酶体激活因子是寒冷诱导的长寿所必需的，并改善年龄相关的蛋白质降解缺陷。此外，寒冷诱导的PA28γ/PSME-3减少了亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化等年龄相关疾病的线虫模型中的蛋白质聚集。值得注意的是，将人类细胞暴露于中等低温（36 °C）也通过PA28γ/PSME3激活胰蛋白酶样活性，减少疾病相关蛋白聚集和神经变性。总之，我们的发现揭示了低温的有益作用，这种作用跨越进化边界，对多种疾病的预防具有潜在意义。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 低温如何延长寿命并影响疾病相关蛋白聚集？
- 核心机制
- 低温通过TRPA1激活转录因子NHR-49，上调PA28γ/PSME3，进而激活蛋白酶体胰蛋白酶样活性，促进不依赖于泛素化的蛋白质降解，减少聚集。
- 主要证据
- C. elegans中psme-3敲低降低低温诱导的胰蛋白酶样活性并缩短寿命；人类HEK293细胞中PSME3敲低阻断低温诱导的突变HTT和FUS降解。
- 研究意义
- 揭示低温跨物种调控蛋白稳态的机制，为多种年龄相关疾病提供潜在干预靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PSME-3在低温诱导的胰蛋白酶样活性中的作用
验证PSME-3是否介导低温诱导的胰蛋白酶样活性
通过RNAi敲低psme-3或过表达psme-3，检测蛋白酶体活性。
TRPA1和NHR-49在PSME-3表达调控中的作用
探究TRPA1和NHR-49是否调控低温下的PSME-3表达
使用trpa-1突变体或nhr-49 RNAi，检测PSME-3蛋白和mRNA水平。
PSME-3对低温诱导长寿的影响
确定PSME-3是否介导低温诱导的长寿
在psme-3 RNAi或过表达下进行寿命测定。
低温对疾病相关蛋白聚集的影响及PSME-3依赖
低温是否减少疾病相关蛋白聚集，且是否依赖PSME-3
使用表达polyQ67、FUSP525L或TDP-43M331V的C. elegans模型或HEK293细胞，检测蛋白聚集和总蛋白水平。
低温对人类细胞神经变性的影响
低温是否通过PSME3减少ALS运动神经元凋亡
将ALS-iPSC衍生的运动神经元置于36 °C，检测凋亡和PSME3依赖。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质印迹 | 抗PSME3抗体 | Abcam | ab97576 |
| 抗20S蛋白酶体C2抗体 | Abcam | ab3325 | |
| 抗PSMD11抗体 | Abcam | ab99413 | |
| 抗TRPA1抗体 | Proteintech | 19124-1-AP | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | T6199 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8226 | |
| 抗FUS抗体 | Abcam | ab154141 | |
| 抗TDP43抗体 | Abcam | ab225710 | |
| 抗亨廷顿蛋白抗体 | Cell Signaling | 5656 | |
| 抗GFP抗体 | AMSBIO | TP401 | |
| 抗IFB-2抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | MH33 | |
| 免疫细胞化学 | 抗剪切型Caspase-3兔单抗 | Cell Signaling | 9661S |
| 抗MAP2小鼠单抗 | Sigma-Aldrich | M1406 | |
| 抗PSME3兔多抗 | Proteintech | 14907-1-AP | |
| 抗FUS小鼠单抗 | Abcam | ab154141 | |
| 抗HA标签小鼠单抗 | ThermoFisher | 26183 | |
| Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG二抗 | ThermoFisher | A-11029 | |
| Alexa Fluor 568标记山羊抗兔IgG二抗F(ab')2片段 | ThermoFisher | A-21069 | |
| Hoechst 33342染料 | ThermoFisher | H3570 | |
| ProLong Diamond防淬灭封片剂 | ThermoFisher | P36961 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | ThermoFisher | 11966025 |
| 胎牛血清 | ThermoFisher | 10500064 | |
| MEM非必需氨基酸 | ThermoFisher | 11140035 | |
| iPSC培养 | Geltrex基质胶 | ThermoFisher | A1413302 |
| mTeSR1培养基 | Stem Cell Technologies | 85850 | |
| 分散酶 | Stem Cell Technologies | 07913 | |
| 运动神经元分化 | DMEM/F12培养基 | ThermoFisher | 11330057 |
| Neurobasal培养基 | ThermoFisher | 21103049 | |
| Glutamax补充剂 | ThermoFisher | 35050038 | |
| B27补充剂 | ThermoFisher | 12587010 | |
| N2补充剂 | ThermoFisher | 17502048 | |
| 视黄酸 | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| Smoothened激动剂 | Sigma-Aldrich | 566661 | |
| LDN-193189 | Miltenyi Biotech | 130-103-925 | |
| SB-431542 | Miltenyi Biotech | 130-105-336 | |
| SU-5402 | Sigma-Aldrich | SML0443 | |
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| 多聚L-鸟氨酸 | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| 层粘连蛋白 | ThermoFisher | 23017015 | |
| 脑源性神经营养因子 | Biozol | 450-02 | |
| 胶质细胞源性神经营养因子 | Biozol | 450-10 | |
| 基因敲低 | Mission shRNA载体 | Sigma-Aldrich | -- |
| 嘌呤霉素 | ThermoFisher | A1113803 | |
| ROCK抑制剂 | Abcam | ab120129 | |
| Accutase消化液 | ThermoFisher | A1110501 | |
| 质粒转染 | Fugene HD转染试剂 | Promega | E2311 |
| 蛋白酶体活性测定 | 胰蛋白酶样活性底物 | Enzo | BWL-AW9785-0005 |
| 胰凝乳蛋白酶样活性底物 | Enzo | BML-ZW8505-0005 | |
| caspase样活性底物 | Enzo | BWL-ZW9345-0005 | |
| EnSpire多功能酶标仪 | Perkin Elmer | -- | |
| 蛋白质印迹 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | 11836153001 |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoScientific | 23225 | |
| 基因敲低 | Gentra Puregene组织DNA提取试剂盒 | Qiagen | -- |
| qPCR | RNAbee RNA提取试剂 | Tel-Test Inc. | CS501-B |
| qScript Flex cDNA合成试剂盒 | Quantabio | -- | |
| CFC384实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞处理 | HC-030031（TRPA1拮抗剂） | -- | -- |
| 来普霉素B（核输出抑制剂） | Sigma-Aldrich | -- | |
| 线虫培养 | OP50大肠杆菌 | -- | -- |
| 线虫RNAi | HT115大肠杆菌 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 线虫培养与温度处理 | 线虫株系（如N2、fer-15;fem-1）、培养温度（20°C）、成虫后转移温度（15、20、25°C） 阅读提示：Methods: C. elegans strains; Lifespan studies |
| 蛋白酶体活性测定 | 底物种类（Ac-RLR-AMC等）、蛋白量（25 μg）、裂解缓冲液成分、荧光读取条件（380/460 nm） 阅读提示：Methods: Proteasome activity |
| 基因敲低 | RNAi起始时间（成虫第1天）、psme-3 RNAi质粒构建、组织特异性RNAi菌株（如DCL569等） 阅读提示：Methods: RNAi constructs for C. elegans; C. elegans strains |
| 寿命测定 | 每条件蠕虫数（96）、评分频率（每天或隔天）、审查标准（丢失、袋状等） 阅读提示：Methods: Lifespan studies |
| 人类细胞培养与低温处理 | HEK293T/17细胞系、培养基（DMEM+10%FBS）、低温处理（36°C 24小时） 阅读提示：Methods: Human cell lines |
| iPSC衍生运动神经元分化 | iPSC系（FUSP525L/P525L）、分化方案（24天）、细胞因子浓度 阅读提示：Methods: Motor neuron differentiation |