粪便样本采集与处理
收集CVID患者和健康供者的粪便样本用于后续分析。
在德国弗赖堡大学医学中心伦理批准后，于2015年9月至2017年6月期间，使用含稳定液的试管采集粪便样本，并要求24小时内寄送。样本均质化后分装，-80°C保存。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
粪便免疫球蛋白水平作为常见变异型免疫缺陷病患者肠道微生物组的调节因子
Fecal Immunoglobulin Levels as a Modifier of the Gut Microbiome in Patients with Common Variable Immunodeficiency
实验完整度
中该研究为横断面观察性研究，包含患者和健康对照的粪便样本，进行了16S rRNA基因测序和ELISA检测，并进行了相关性和差异丰度分析，但缺乏功能验证或机制实验。
主要模型
CVID患者粪便样本 健康供者粪便样本（包括健康家庭对照）
重点核对
粪便样本采集：使用含8 ml稳定液的试管，采样后24小时内寄送 排除标准：采样前4周内使用抗生素、益生菌和免疫抑制药物（≤5 mg泼尼松除外） 16S rRNA基因测序：V3-V4区域，MiSeq平台，2×300循环V3试剂盒 粪便免疫球蛋白测量：ELISA法，标准化至蛋白质浓度 患者亚组划分：根据HDs免疫球蛋白水平的第一或第三四分位数
摘要
目的：常见变异型免疫缺陷病（CVID）是最常见的临床相关的先天性免疫错误。在这些患者中，已描述了肠道微生物组组成改变且多样性降低。我们试图研究CVID患者粪便免疫球蛋白水平及其对肠道微生物群的影响。方法：我们分析了28名CVID患者和42名健康供者（HDs）的肠道微生物组，包括21名健康家庭对照，通过对粪便样本中提取的细菌16S rRNA基因的V3和V4区域进行测序。通过ELISA测量27名CVID患者和41名HDs的粪便中免疫球蛋白A、M和G的水平，并针对蛋白质浓度进行标准化。结果：我们测量到与HDs相比，CVID患者粪便样本中IgA降低，IgG升高。粪便IgA和IgM水平降低与微生物多样性降低和生态失调增加相关。我们鉴定了大量显著差异丰度的分类群，尤其是在IgA水平降低的患者中，但在IgM水平降低的患者中也是如此，与其对照组相比。结论：CVID患者的肠道微生物群组成发生改变，这在粪便IgA和IgM水平降低的患者中最为普遍。在这项研究中，我们将粪便免疫球蛋白确定为CVID患者肠道微生物组的潜在调节因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CVID患者粪便免疫球蛋白水平是否改变，以及它们与肠道微生物组组成和多样性的关系。
- 核心机制
- 粪便IgA和IgM的缺乏可能导致肠道微生物组改变，特别是促进潜在病原菌如Gammaproteobacteria的生长，从而引起生态失调和微生物易位。
- 主要证据
- 与HDs相比，CVID患者粪便IgA水平降低，IgG水平升高；低IgA和IgM水平与降低的微生物α多样性和增加的生态失调指数相关；低IgA和IgM患者中特定分类群如Enterobacterales富集。
- 研究意义
- 该研究将粪便免疫球蛋白确定为CVID患者肠道微生物组的潜在调节因子，提示分泌型IgA和IgM在肠道稳态中的重要性，可能为理解CVID的免疫失调提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
16S rRNA基因测序
分析粪便样本中细菌群落的组成和多样性。
从粪便样本中提取微生物DNA，扩增16S rRNA基因V3-V4区域，在Illumina MiSeq平台进行高通量测序。
粪便免疫球蛋白水平测量
定量粪便中IgA、IgM和IgG的水平，并比较CVID患者与健康对照的差异。
通过离心收集粪便上清液，使用ELISA法测量免疫球蛋白水平，并标准化至蛋白质浓度。
微生物多样性与生态失调分析
评估CVID患者与健康对照的微生物α多样性和生态失调指数，并分析其与粪便免疫球蛋白水平的关系。
使用USEARCH和R包计算α多样性指数（Fisher、Shannon、Chao1）和CVID特异性生态失调指数，并比较不同免疫球蛋白水平亚组之间的差异。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
微生物组分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 粪便样本采集 | 含稳定液的粪便采集管 | Stratec | -- |
| DNA提取 | QIAamp DNA粪便迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| ELISA | 山羊抗人IgG-UNLB | Southern Biotech | -- |
| 山羊抗人IgA-UNLB | Southern Biotech | -- | |
| 山羊抗人IgM-UNLB | Southern Biotech | -- | |
| 山羊抗人IgG-AP | Southern Biotech | -- | |
| 山羊抗人IgA-AP | Southern Biotech | -- | |
| 山羊抗人IgM-AP | Southern Biotech | -- | |
| 蛋白质浓度测量 | Pierce BCA蛋白测定试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| 测序 | MiSeq | Illumina | -- |
| ELISA | 康宁96孔半面积板 | Corning | -- |
| 测序 | 16S扩增PCR正向引物 | -- | -- |
| 16S扩增PCR反向引物 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本采集 | 样本来源：CVID患者和健康供者；采集时间：2015年9月至2017年6月；样本保存：-80°C 阅读提示：Methods: Sample Collection |
| DNA提取 | 使用QIAamp DNA Stool Mini Kit，裂解温度95°C，使用400 μl上清液和400 μl AL缓冲液，离心柱上样两次。 阅读提示：Methods: Fecal Microbial DNA Isolation |
| 16S rRNA基因测序 | 引物序列：V3-V4区域；测序平台：Illumina MiSeq，2×300循环V3试剂盒 阅读提示：Methods: 16S Ribosomal RNA Gene Sequencing |
| 免疫球蛋白测量 | ELISA法；包被抗体浓度5 μg/ml；二抗稀释1:500；标准曲线从2 μg/ml开始；波长405 nm。 阅读提示：Methods: Measurement of Fecal Immunoglobulin Levels |
| 蛋白质测量 | 使用Pierce BCA试剂盒，标准曲线从2000 μg/ml到12.5 μg/ml，波长562 nm。 阅读提示：Methods: Measurement of Fecal Protein Levels |
| 患者亚组划分 | 基于HDs免疫球蛋白水平的第一四分位数（IgA、IgM）和第三四分位数（IgG）进行划分。 阅读提示：Methods: Division of Patients into Subgroups According to Immunoglobulin Levels |