样本收集与质量控制
获取符合实验要求的晚期非小细胞肺癌组织样本，并进行质量评估。
从接受KN046治疗的患者中收集FFPE组织样本，进行DSP蛋白和RNA分析，并进行质量控制（QC）。
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空间多组学揭示肿瘤生态系统异质性对接受双特异性抗体治疗的晚期非小细胞肺癌患者免疫治疗疗效的影响
Spatial multi-omics revealed the impact of tumor ecosystem heterogeneity on immunotherapy efficacy in patients with advanced non-small cell lung cancer treated with bispecific antibody
实验完整度
中研究包含DSP蛋白质与RNA分析、mIHC验证、模拟bulk比较及独立队列验证，但未进行体外或体内功能实验。
主要模型
晚期非小细胞肺癌患者组织样本（FFPE切片） 独立验证队列（65例接受ICIs治疗的NSCLC患者）
重点核对
DSP蛋白面板（44个靶标）和RNA面板（1812个基因探针） 肿瘤与基质区域的分割策略（panCK和CD45标志物） KN046给药方案（每14天静脉注射） 疗效分组标准（RECIST V.1.1） 基质区域18蛋白签名评分计算
摘要
背景
恶性肿瘤的免疫治疗取得了巨大进展，但许多患者并未从中获益。复杂的瘤内异质性（ITH）阻碍了免疫治疗的深入探索。传统的体积测序掩盖了瘤内复杂性，无法更详细地发现ITH对治疗效果的影响。因此，我们启动这项研究，在多组学空间水平探索ITH，并在考虑ITH的情况下寻找免疫治疗疗效的预后生物标志物。
方法
利用数字空间分析（DSP）的分割策略，我们在蛋白质组和转录组水平获得了肿瘤和基质区域的差异信息。基于对ITH的考虑，不同区域候选蛋白构建的签名被用于预测免疫治疗的疗效。
结果
本研究共纳入18例接受双特异性抗体（bsAb）-KN046治疗的患者。同一患者的肿瘤和基质区域表现出不同的特征。分别由肿瘤和基质区域中11个和18个差异表达的DSP标记物组成的签名与治疗反应相关。此外，从基质区域识别的空间解析签名对bsAb免疫治疗反应显示出更大的预测能力（曲线下面积=0.838）。随后，我们的基质签名在接受免疫治疗的非小细胞肺癌患者的独立队列中得到了验证。
结论
我们在空间水平解密了ITH，并首次证明基质区域的遗传信息可以更好地预测bsAb治疗的疗效。
试验注册号
NCT03838848。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肿瘤生态系统异质性在空间水平上如何影响接受双特异性抗体治疗的晚期非小细胞肺癌患者的免疫治疗疗效，并寻找考虑异质性后的疗效预测生物标志物。
- 核心机制
- 基质区域的免疫细胞浸润和特定蛋白表达与治疗反应相关，基因信息在基质区域更丰富，能更好预测双特异性抗体治疗疗效。
- 主要证据
- 通过DSP空间分割，在基质区域识别出18个与疗效相关的蛋白标记物，构建签名AUC=0.838，并在独立免疫治疗队列中验证（AUC=0.776）。
- 研究意义
- 研究表明考虑瘤内异质性，从基质区域寻找疗效相关生物标志物可能更准确，为双特异性抗体免疫治疗提供新的预测方法。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
空间分割与多组学数据获取
通过DSP技术将组织分割为肿瘤和基质区域，获取空间分辨的蛋白质和转录组表达数据。
使用GeoMx DSP仪器，结合形态学标志物panCK和CD45进行分割，收集AOIs，通过nCounter和测序平台进行蛋白和RNA定量。
空间异质性分析
评估肿瘤和基质区域之间的表达差异以及空间位置对分子特征的影响。
比较肿瘤与基质AOIs的蛋白和RNA表达，分析分子聚类与空间距离的关系，以及同一ROI内肿瘤-基质相关性。
疗效相关标记物识别
识别与治疗反应相关的差异表达蛋白，评估ITH对生物标志物发现的影响。
比较不同疗效组（PR vs PD）在基质、肿瘤和模拟bulk数据中的蛋白表达，识别差异蛋白，并构建预测签名。
空间签名预测效能评估
评估从基质和肿瘤区域构建的签名预测免疫治疗疗效的能力。
计算签名得分，比较不同区域签名的AUC，并分析签名得分与生存期的关联。
独立队列验证
验证基质区域构建的基因签名在独立免疫治疗队列中的预测效能。
从公共数据集中获取65例NSCLC患者数据，计算基因签名得分，评估其预测反应和生存的效能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 空间蛋白质分析 | 免疫细胞分型核心 | NanoString | -- |
| 免疫肿瘤药物靶点模块 | NanoString | -- | |
| 免疫细胞分型模块 | NanoString | -- | |
| 泛肿瘤模块 | NanoString | -- | |
| UV光裂解寡核苷酸抗体组 | -- | -- | |
| 形态学标志物panCK和CD45 | NanoString | 121300301 | |
| SYTO 13 | NanoString | 121300301 | |
| 空间RNA分析 | 癌症转录组图谱 | NanoString | -- |
| 形态学标志物panCK和CD45 | NanoString | 121300310 | |
| SYTO 13 | NanoString | 121300310 | |
| 空间蛋白质分析 | nCounter FLEX | NanoString | -- |
| 空间RNA分析 | Illumina NextSeq 550AR | Illumina | -- |
| 空间蛋白质分析 | GeoMx数字空间分析仪 | NanoString | -- |
| 空间RNA分析 | GeoMx数字空间分析仪 | NanoString | -- |
| 多重免疫组织化学 | TSA六色试剂盒 | Absinbio | abs50014-100T |
| DAPI | Absinbio | abs47047616 | |
| 抗panCK抗体 | CST | 4545 | |
| 抗兔/鼠辣根过氧化物酶标记二抗 | Absinbio | abs50015-02 | |
| CD11c抗体 | CST | 45581 | |
| 抗Tim3抗体 | Abcam | ab241332 | |
| 抗CD4抗体 | Abcam | ab133616 | |
| 抗CD45抗体 | CST | 13917 | |
| 全景MIDI II | 3DHISTECH | -- | |
| PD-L1检测 | Ventana PD-L1 SP263 | Ventana | -- |
| TMB分析 | KAPA Hyper Prep试剂盒 | KAPA | -- |
| SureSelectXT靶向富集系统 | Agilent | -- | |
| NovaSeq6000 | Illumina | -- | |
| Qubit3 | Thermo Fisher | -- | |
| 数据分析 | ComplexHeatmap | -- | -- |
| umap | -- | -- | |
| pROC | -- | -- | |
| edgeR | -- | -- | |
| KOBAS-i | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 患者纳入标准：18-75岁，IV期NSCLC，EGFR/ALK阴性，一线铂类化疗失败或不耐受；疗效评估采用RECIST V.1.1；样本为FFPE组织 阅读提示：Methods: Patient and sample selection |
| DSP蛋白分析 | FFPE切片厚度4µm；抗原修复条件（高压15min）；一抗孵育（4°C过夜）；UV裂解和收集；QC标准（FOV≥75%，结合密度0.1-2.25，细胞核>20或面积>1600μm²） 阅读提示：Methods: Sample preparation for nanostring GeoMx DSP protein assay; Spatial proteomic data analysis |
| DSP RNA分析 | FFPE切片厚度4µm；蛋白酶K处理（1µg/mL，37°C 15min）；杂交（37°C 16-24h）；QC标准（比对率≥80%，NTC≤1000，负探针≤4，细胞核>100或面积>8000μm²） 阅读提示：Methods: Sample preparation for nanostring GeoMx DSP RNA assay; Spatial transcriptomic data analysis |
| 空间分割 | ROI选择由两位病理学家独立确定；肿瘤区域定义为panCK阳性，基质区域为panCK阴性；每个样本ROI数量1-17个 阅读提示：Methods: Digital spatial profiling |
| 签名构建与验证 | 差异蛋白筛选阈值p<0.05；签名得分公式[Σ(log2(Xi+1))-Σ(log2(Yk+1))]/N；验证队列基因签名计算使用中位数分组 阅读提示：Methods: Construction of the predictive signature; Calculation of the predictive signature score from the validation cohort |