CD40信号对巨噬细胞代谢的影响
评估CD40激活是否改变巨噬细胞的线粒体活性、脂质摄取和代谢表型。
通过FGK45刺激BMDMs，检测TMRM/MG比率、脂质摄取（Bodipy-FL C12）、脂质含量（Bodipy-493/503）、OCR和ECAR。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
CD40信号重编程脂肪酸和谷氨酰胺代谢以刺激巨噬细胞的抗肿瘤功能
CD40 signal rewires fatty acid and glutamine metabolism for stimulating macrophage anti-tumorigenic functions
实验完整度
高包含体外BMDM代谢分析、基因敲除、体内肿瘤模型及骨髓移植等多层级实验，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
YUMM1.7黑色素瘤小鼠模型 骨髓来源巨噬细胞（BMDM） 肿瘤相关巨噬细胞（TAM） 骨髓移植小鼠模型
重点核对
FGK45单克隆抗体处理浓度及方式 CPT1A基因敲除对FAO及抗肿瘤反应的影响 LDHA基因敲除对乳酸产生及组蛋白乙酰化的影响 GLS1基因敲除对谷氨酰胺代谢及抗肿瘤反应的影响 NAD+/NADH比率在CD40介导的极化中的作用
摘要
暴露于脂多糖会触发巨噬细胞促炎极化，并伴随代谢重编程，其特征是有氧糖酵解升高和三羧酸循环中断。然而，与脂多糖不同，CD40信号能够通过一些尚未明确的代谢编程驱动促炎和抗肿瘤极化。在这里，我们表明CD40激活触发脂肪酸氧化（FAO）和谷氨酰胺代谢，通过ATP柠檬酸裂解酶依赖的表观遗传重编程促进巨噬细胞中促炎基因和抗肿瘤表型。机制上，谷氨酰胺利用通过谷氨酰胺到乳酸的转化微调NAD+/NADH比率，从而增强FAO诱导的促炎和抗肿瘤激活。参与CD40介导的代谢重编程的重要代谢酶的基因消融消除了激动性抗CD40诱导的抗肿瘤反应和肿瘤相关巨噬细胞的再教育。总之，这些数据表明代谢重编程（包括FAO和谷氨酰胺代谢）控制促炎和抗肿瘤极化的激活，并强调了在激动性抗CD40治疗前对肿瘤相关巨噬细胞进行代谢预 conditioning 的治疗潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CD40信号如何通过代谢重编程驱动巨噬细胞促炎和抗肿瘤极化？
- 核心机制
- CD40激活触发脂肪酸氧化和谷氨酰胺代谢，谷氨酰胺通过转化为乳酸调控NAD+/NADH比率，从而支持脂肪酸氧化，并通过ACLY依赖的组蛋白乙酰化促进促炎基因表达。
- 主要证据
- 体外BMDM实验显示FGK45增加OCR和脂肪酸氧化，基因敲除CPT1A、ACLY、LDHA或GLS1消除了FGK45诱导的促炎基因表达；体内肿瘤模型中，敲除这些基因的骨髓移植小鼠中FGK45的抗肿瘤效果消失。
- 研究意义
- 研究揭示了CD40介导的巨噬细胞极化依赖于脂肪酸氧化和谷氨酰胺代谢，并提出通过代谢预 conditioning 肿瘤相关巨噬细胞可能增强激动性抗CD40抗体的抗肿瘤疗效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证脂肪酸氧化在CD40介导的极化中的作用
确定FAO是否支持CD40驱动的促炎极化。
使用etomoxir或trimetazidine抑制FAO，或通过CRISPR-Cas9敲除Cpt1a，检测促炎基因表达和OCR。
分析脂肪酸氧化对组蛋白乙酰化的贡献
探究FAO来源的乙酰-CoA是否通过ACLY促进组蛋白乙酰化。
使用13C标记的棕榈酸追踪H3K27ac标记，敲除Acly或使用ACLY抑制剂，检测组蛋白乙酰化和促炎基因表达。
确定乳酸产生在CD40介导的极化中的作用
评估乳酸产生是否对CD40驱动的促炎极化至关重要。
敲除Ldha，检测乳酸产生、组蛋白乙酰化、促炎基因表达和体内肿瘤生长。
验证乳酸产生通过调控NAD+/NADH比率支持OXPHOS
确定乳酸产生是否通过调节NAD+/NADH比率来维持OXPHOS和促炎极化。
检测NAD+/NADH比率，使用NR补充NAD+，检测OCR、SRC和促炎基因表达。
探究谷氨酰胺代谢对乳酸产生的贡献
确定谷氨酰胺是否作为乳酸产生的底物，并支持CD40介导的极化。
通过谷氨酰胺剥夺或敲除Gls1，检测乳酸产生、ECAR、NAD+/NADH比率、促炎基因表达和体内肿瘤生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Thermo Fisher | -- |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | -- | |
| 透析胎牛血清 | Thermo Fisher | -- | |
| 药物处理 | FGK45抗小鼠CD40单克隆抗体 | Bio X Cell | BP0016-2 |
| 山羊抗大鼠IgG | BioLegend | 405401 | |
| 代谢抑制 | 依托莫昔 | Sigma | -- |
| 曲美他嗪 | 文中未明确说明 | -- | |
| ACLY抑制剂 | Sigma | -- | |
| p300抑制剂 | 文中未明确说明 | -- | |
| 苹果酸酶抑制剂 | 文中未明确说明 | -- | |
| PEPCK抑制剂 | 文中未明确说明 | -- | |
| 代谢物补充 | 烟酰胺核苷 | 文中未明确说明 | -- |
| 乙酸钠 | 文中未明确说明 | -- | |
| 细胞染色 | 线粒体绿色荧光探针 | Thermo Fisher | -- |
| 四甲基罗丹明甲酯 | Thermo Fisher | -- | |
| BODIPY-FL C12 | Thermo Fisher | C3927MP | |
| BODIPY-493/503 | Thermo Fisher | D3922 | |
| 药物处理 | LIVE/DEAD可固定紫色细胞染色试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| 流式分析 | Brilliant Violet 650抗小鼠CD45抗体 | BioLegend | 03151 |
| Pacific Blue抗小鼠/人CD11b抗体 | BioLegend | 101224 | |
| PE/Cy7抗小鼠Ly-6G/Ly-6C抗体 | BioLegend | 108416 | |
| APC-Cy7抗小鼠F4/80抗体 | BioLegend | 123116 | |
| Attune NxT流式细胞仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 代谢检测 | Seahorse XF24细胞外通量分析仪 | Seahorse Bioscience | -- |
| 乳酸比色/荧光检测试剂盒 | BioVision | K607 | |
| PicoProbe乙酰辅酶A检测试剂盒 | Abcam | ab87546 | |
| 柠檬酸检测试剂盒 | Abcam | ab83396 | |
| NAD/NADH定量比色试剂盒 | BioVision | K337 | |
| 蛋白质检测 | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Sigma-Aldrich | 17-295 |
| 微球菌核酸酶 | NEB | M0247S | |
| 抗乙酰化组蛋白H3抗体 | Millipore | 06-599 | |
| 抗乙酰化组蛋白H4抗体 | Millipore | 06-866 | |
| 抗组蛋白H3（乙酰化K27）抗体 | Abcam | 4729 | |
| 抗IgG | Santa Cruz | SC-2027 | |
| 免疫印迹 | 抗ACLY抗体 | CST | 4332 |
| 抗CPT1A抗体 | Abcam | ab128568 | |
| 抗LDHA抗体 | CST | 2012 | |
| 抗GLS抗体 | Thermo Fisher | 701965 | |
| 抗MDH1抗体 | Abcam | ab180152 | |
| 抗AMPK α1抗体 | Abcam | ab32047 | |
| 抗磷酸化AMPKα（Thr172）抗体 | CST | 4188 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma | A5441 | |
| 抗组蛋白H3（C端）抗体 | BioLegend | 819411 | |
| 抗组蛋白H4抗体 | CST | 13919 | |
| 分子克隆 | Lipofectamine LTX转染试剂 | Thermo Fisher | -- |
| OptiMEM培养基 | Thermo Fisher | 11058021 | |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher | -- | |
| TRIzol试剂 | Life Technologies | -- | |
| miRNeasy小型试剂盒 | Qiagen | -- | |
| M-MLV逆转录酶 | Promega | -- | |
| LightCycler 480仪器II | Roche Life Science | -- | |
| KAPA SYBR FAST qPCR试剂盒预混液 | KAPA Biosystems | -- | |
| 动物实验 | Rad Source RS-2000 X射线照射器 | Rad Source | -- |
| 代谢检测 | Q-Exactive Plus质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| Ultimate 3000 RSLCnano高效液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- | |
| Agilent 7890A气相色谱系统 | Agilent | -- | |
| Agilent 5975C惰性质谱系统 | Agilent | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BMDM分化与刺激 | BMDM分化时间、FGK45浓度、培养基成分 阅读提示：Methods: Bone marrow-derived macrophage generation and FGK45 stimulation |
| 基因敲除 | sgRNA序列、CRISPR-Cas9敲除效率、嘌呤霉素筛选浓度 阅读提示：Methods: Generation of bone marrow-derived macrophages with gene ablation |
| 代谢分析 | Seahorse分析中的药物浓度（oligomycin, FCCP, rotenone, antimycin A, etomoxir）、OCR/ECAR测量条件 阅读提示：Methods: Flow cytometry-based metabolic analyses and Seahorse assays |
| 体内肿瘤模型 | YUMM1.7细胞接种量、FGK45给药剂量和途径 阅读提示：Methods: Tumor engraftment and FGK45 treatment in vivo |
| 代谢追踪 | 13C标记棕榈酸和谷氨酰胺的浓度、标记时间 阅读提示：Methods: 13C-labeled palmitic acid and glutamine incorporation on histone H3 |