验证胞葬作用诱导糖酵解
确定胞葬作用是否以及如何影响巨噬细胞的糖酵解。
使用Seahorse代谢分析，将BMDM和HMDM与凋亡细胞共孵育45分钟（脉冲），洗涤后进行不同时间的追踪（1、6、24小时），测量ECAR和OCR。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
PFKFB2介导的糖酵解促进巨噬细胞通过乳酸驱动持续胞葬作用
PFKFB2-mediated glycolysis promotes lactate-driven continual efferocytosis by macrophages
实验完整度
高包含体外细胞实验（BMDM/HMDM）、siRNA敲低、Seahorse代谢分析、体内骨髓移植及地塞米松胸腺模型等多个独立证据层级，并进行功能验证与机制验证。
主要模型
小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM） 人单核细胞来源巨噬细胞（HMDM） PFKFB2突变小鼠骨髓移植的C57BL/6J小鼠 地塞米松诱导的胸腺细胞凋亡模型
重点核对
使用PFKFB2突变小鼠的BMDM验证糖酵解缺陷 使用siRNA敲低Pfkfb2或Slc2a1验证糖酵解和葡萄糖摄取 使用2-DG和乳酸处理验证糖酵解和乳酸的作用 使用地塞米松诱导的胸腺细胞凋亡模型验证体内胞葬作用 使用BAPTA-AM或MK-2206处理验证钙信号和Akt的作用
摘要
消退型巨噬细胞通过胞葬作用清除凋亡细胞，从而预防慢性炎症。这些巨噬细胞被认为主要依赖氧化磷酸化，但新出现的证据提示胞葬作用与糖酵解之间可能存在联系。为了进一步深入了解这一问题，我们研究了参与胞葬作用诱导的巨噬细胞糖酵解及其后果的分子-细胞机制。我们发现，胞葬作用促进巨噬细胞糖酵解的短暂增加，这依赖于6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶2（PFKFB2）的快速激活，这将此过程与促炎巨噬细胞中的糖酵解区分开来。移植了激活缺陷型PFKFB2骨髓的小鼠，在经受地塞米松诱导的胸腺细胞凋亡后，与野生型对照小鼠相比，表现出胸腺胞葬作用受损、胸腺坏死增加，以及胸腺巨噬细胞上胞葬作用受体MerTK和LRP1的表达降低。体外机制研究表明，摄取第一个凋亡细胞所刺激的糖酵解，通过乳酸介导的MerTK和LRP1上调，促进持续的胞葬作用。因此，胞葬作用诱导的巨噬细胞糖酵解代表一种独特的代谢过程，以乳酸依赖的方式维持持续的胞葬作用。该过程与炎性巨噬细胞糖酵解的区别，提示它可能被治疗性地增强，以促进慢性炎症疾病中的胞葬作用和消退。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 胞葬作用如何诱导巨噬细胞糖酵解，以及这种糖酵解如何促进持续的胞葬作用，并且是否与炎症诱导的糖酵解存在区别。
- 核心机制
- 胞葬作用通过Akt介导的TXNIP磷酸化，抑制GLUT1内吞，增加葡萄糖摄取；同时Akt磷酸化PFKFB2，激活PFK-1，促进糖酵解。产生的乳酸经钙信号上调MerTK和LRP1的细胞表面表达，增强后续凋亡细胞结合，驱动持续胞葬作用。
- 主要证据
- 体外实验显示，胞葬作用刺激BMDM和HMDM的糖酵解短暂增加，依赖PFKFB2；siRNA敲低Pfkfb2或Slc2a1减弱该效果。乳酸处理恢复持续胞葬作用缺陷，并上调MerTK/LRP1细胞表面表达；阻断钙信号可消除此效应。体内使用PFKFB2突变骨髓移植小鼠，显示胸腺胞葬作用受损、坏死增加，且巨噬细胞MerTK/LRP1表达降低。
- 研究意义
- 该研究揭示了胞葬作用诱导的糖酵解与炎症诱导的糖酵解存在机制上的区别，提示通过靶向PFKFB2介导的糖酵解可能为增强胞葬作用和促进慢性炎症消退提供新的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
探究PFKFB2和TXNIP的作用
确定PFKFB2和TXNIP是否参与胞葬作用诱导的糖酵解，并探索其上游信号。
使用免疫印迹检测胞葬作用后PFKFB2和TXNIP的磷酸化水平，使用siRNA敲低Pfkfb2、Slc2a1或Txnip，使用Akt抑制剂MK-2206处理，观察对糖酵解、葡萄糖摄取和PFKFB2/TXNIP磷酸化的影响。
评估持续胞葬作用
验证糖酵解和乳酸是否影响巨噬细胞连续摄取多个凋亡细胞的能力。
进行连续胞葬作用实验，用绿色荧光标记的凋亡细胞进行首次孵育，2小时间隔后，用红色荧光标记的凋亡细胞进行第二次孵育，评估双阳细胞比例。使用2-DG、siPfkfb2、siLdha、乳酸、DCA、MK-2206、BAPTA-AM、中和抗体等处理。
分析乳酸对受体表达和钙信号的影响
确定乳酸是否通过钙信号上调MerTK和LRP1的细胞表面表达以增强胞葬作用。
使用免疫荧光和图像分析检测PFKFB2突变或siPfkfb2处理后的BMDM中MerTK和LRP1的细胞表面表达。使用Fluo-8-AM钙染色和活细胞成像评估胞内钙水平。使用BAPTA-AM螯合胞内钙。
体内验证PFKFB2功能
在体内评估PFKFB2对巨噬细胞胞葬作用和组织消退的重要性。
将PFKFB2突变小鼠或野生型小鼠的骨髓移植到受照射的C57BL/6J小鼠中，4周后进行地塞米松胸腺实验。分析胸腺重量、细胞数、凋亡细胞、巨噬细胞数量、体内胞葬作用、坏死区域以及MerTK和LRP1的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证机制链路
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Corning | 10-013-CV |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Corning | -- | |
| RPMI-1640培养基 | Corning | 10-040 | |
| 细胞极化 | 脂多糖 | -- | -- |
| 重组小鼠IFN-γ | PeproTech | -- | |
| 重组人IFN-γ | PeproTech | -- | |
| 重组小鼠IL-4 | PeproTech | -- | |
| 重组人IL-4 | PeproTech | -- | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PreproTech | -- | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | PreproTech | -- | |
| 阴性对照 | 乱序RNA | Dharmacon | -- |
| 基因沉默 | siRNA（ON-TARGETplus SMARTPool） | Dharmacon | -- |
| Lipofectamine RNAi-MAX转染试剂 | Life Technologies | -- | |
| 代谢分析 | Seahorse XF96分析仪 | Seahorse Bioscience | -- |
| Seahorse XF DMEM测定培养基 | Seahorse Bioscience | 103575-100 | |
| 2-NBDG | Thermo Fisher | -- | |
| Fluo-8-AM钙离子荧光探针 | Abcam | -- | |
| 乳酸检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞染色 | pHrodo染料 | Thermo Fisher | -- |
| PKH26染料 | Sigma-Aldrich | -- | |
| PKH67染料 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 药物处理 | MK-2206（Akt抑制剂） | -- | -- |
| 2-脱氧葡萄糖（2-DG） | -- | -- | |
| 乳酸 | -- | -- | |
| BAPTA-AM（钙螯合剂） | -- | -- | |
| 细胞松弛素D | -- | -- | |
| Western blot | Laemmli样品缓冲液 | Bio-Rad | -- |
| Novex 4-20% Tris-甘氨酸梯度凝胶 | Invitrogen | -- | |
| SuperSep Phos-tag凝胶 | FUJIFILM Wako | -- | |
| 抗PFKFB2抗体 | CST | 13045 | |
| 抗磷酸化PFKFB2抗体 | CST | 13064 | |
| 抗Akt抗体 | CST | 4691 | |
| 抗磷酸化Akt抗体 | CST | 4060 | |
| 抗TXNIP抗体 | CST | 14715 | |
| 抗MerTK抗体 | R&D systems | AF591 | |
| 抗LRP1抗体 | Abcam | Ab92544 | |
| 抗β-actin抗体 | CST | 5125 | |
| LC-MS/MS | QTRAP 6500 LC-MS/MS系统 | SCIEX | -- |
| 动物实验 | 地塞米松 | Sigma-Aldrich | -- |
| 新霉素 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | 原位细胞死亡检测试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| 抗GLUT1抗体 | Abcam | Ab15309 | |
| 抗Mac2抗体 | Cedarlane | CL8942LE | |
| 含DAPI的ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Invitrogen | -- | |
| 基因表达分析 | PureLink RNA Mini试剂盒 | Life Technologies | -- |
| NanoDrop分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| 7500实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 流式细胞术 | TruStain FcX（抗小鼠CD16/32） | Biolegend | -- |
| Alexa Fluor 647抗GLUT1抗体 | Abcam | ab195020 | |
| FITC抗F4/80抗体 | Biolegend | 123108 | |
| FITC膜联蛋白V | Biolegend | 640906 | |
| 显微镜 | 荧光显微镜 | Leica | DMI6000B |
| 转盘共聚焦显微镜 | Nikon | Eclipse Ti |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | BMDM培养基含20% L-929条件培养基；HMDM培养基含GM-CSF或M-CSF 阅读提示：Methods：Generation of BMDMs；Generation of HMDMs |
| 凋亡细胞制备 | Jurkat细胞经UV照射15分钟，PBS孵育2-3小时，与巨噬细胞比例5:1 阅读提示：Methods：Generation of apoptotic Jurkat cells |
| siRNA转染 | 使用Dharmacon ON-TARGETplus SMARTPool siRNA，浓度20 nM，Lipofectamine RNAi-MAX转染 阅读提示：Methods：siRNA-mediated gene silencing |
| Seahorse分析 | 细胞密度20,000细胞/孔，培养基为Seahorse XF DMEM，底物浓度：葡萄糖20 mM、寡霉素2 μM、2-DG 80 mM 阅读提示：Methods：Seahorse analysis |
| 胞葬作用实验 | 凋亡细胞与巨噬细胞比例5:1，孵育45分钟，连续胞葬作用间隔2小时 阅读提示：Methods：Single and continual efferocytosis assays |
| 体内实验 | 小鼠品系C57BL/6J，辐射剂量1000 rads，骨髓细胞注射量2.5×10^6，地塞米松剂量250 μg 阅读提示：Methods：Mouse husbandry；Bone marrow transplantation；Dexamethasone–thymus assay |