样本采集与代谢保护
在保持代谢状态完整的前提下获取心脏组织样本
心脏在体外用冰冷冷高钾心脏麻痹液原位停跳，切除后冷缺血时间小于4小时，左室游离壁样本液氮速冻；血浆样本在肝素前采集并处理。
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人类终末期非缺血性扩张型心肌病心脏代谢的综合图景
Integrated landscape of cardiac metabolism in end-stage human nonischemic dilated cardiomyopathy
实验完整度
高结合组织与血浆代谢组学、RNA-seq、蛋白质组学及Western blot和PDH活性测定，从多个独立证据层级（分子、蛋白、代谢物及体内动静脉梯度）进行验证，实验设计系统且深入。
主要模型
离体人心肌组织（终末期非缺血性扩张型心肌病 vs 非衰竭供体） 血浆样本（来自同一患者队列） 经皮冠状动脉介入患者（用于动静脉梯度分析）
重点核对
代谢物提取和LC-MS条件（包括溶剂、色谱柱、质谱参数） RNA-seq和蛋白质组学分析的批次效应校正及归一化方法 样本采集时的冷缺血时间和心麻痹液灌注方案
摘要
心力衰竭（HF）是导致死亡的主要原因。衰竭的心脏会发生深刻的代谢变化，但对人类的全面评估尚缺乏。我们整合了678种代谢物的血浆和心脏组织代谢组学、全基因组RNA测序和蛋白质组学研究，检测了来自39例终末期HF患者和48例非衰竭供体的87颗外植人心脏的代谢状态。我们证实了人HF中的生物能量缺陷，并揭示了维持ATP水平所需的腺嘌呤嘌呤的选择性耗竭。我们观察到衰竭组织中脂肪酸和酰基肉碱显著减少，尽管血浆升高，提示心肌细胞脂肪酸摄取缺陷。相反，葡萄糖水平升高。丙酮酸脱氢酶（门控碳水化合物氧化的酶）被去抑制，允许乳酸和丙酮酸燃烧增加。三羧酸循环中间产物显著减少。最后，生物活性脂质被深刻重编程，神经酰胺显著减少，溶血甘油磷脂升高。这些数据揭示了人衰竭心脏中深刻的代谢异常。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类终末期非缺血性扩张型心肌病心脏中发生哪些代谢重编程，以及这些变化如何解释能量缺陷？
- 核心机制
- 能量缺陷部分源于腺嘌呤嘌呤池的耗竭、脂肪酸摄取缺陷（可能涉及ACSL1）以及糖酵解通量相对不足，同时伴有丙酮酸脱氢酶活性增加、三羧酸循环中间产物减少和氨基酸代谢异常。
- 主要证据
- 基于87颗心脏组织的代谢组学发现ATP、磷酸肌酸、脂肪酸、酰基肉碱和TCA中间产物减少，而葡萄糖、酮体和溶血磷脂增加；结合RNA-seq和蛋白质组学显示相关酶表达改变，并通过动静脉梯度推断燃料利用变化。
- 研究意义
- 提供了人类终末期HF心肌代谢异常的全面视图，为理解生物能量缺陷机制和潜在代谢干预提供了依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
代谢组学分析
定量检测心脏组织和血浆中的代谢物
使用液相色谱-质谱联用（LC-MS）检测代谢物，包括极性和脂质，以及酰基辅酶A。
转录组和蛋白质组学分析
评估基因和蛋白质表达水平的变化
对部分心脏组织进行RNA-seq和蛋白质组学分析。
靶向蛋白和酶活性验证
验证关键代谢酶的蛋白质丰度和活性
使用Western blot检测ACSL1、PDK4、HK1等蛋白，并测定PDH活性。
体内燃料利用评估
评估心脏对底物的摄取或释放
在经皮冠状动脉介入患者中采集动脉和冠状窦血样，计算跨冠脉梯度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本采集 | Krebs-Henseleit缓冲液 | -- | -- |
| 代谢物提取 | 冷冻研磨机 | Retsch | -- |
| LC-MS分析 | Q Exactive质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| XBridge BEH Amide色谱柱 | Waters | -- | |
| Atlantis T3色谱柱 | Waters | -- | |
| 酰基辅酶A分析 | Oasis HLB固相萃取柱 | Waters | -- |
| HSS T3色谱柱 | Waters | -- | |
| Western blot | TU缓冲液 | BioRad | 1426425 |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore Sigma | -- | |
| 丽春红S | Sigma-Aldrich | P7170 | |
| ImageQuant LAS 4000成像系统 | GE Healthcare Life Sciences | -- | |
| Acsl1抗体 | Cell Signaling Technology | 4047S | |
| PDK4抗体 | Abcam | ab110336 | |
| AKR1B1抗体 | Thermo Fisher Scientific | 15439-1-AP | |
| ME1抗体 | Abcam | ab97445 | |
| ME3抗体 | Abcam | ab172972 | |
| HK1抗体 | Cell Signaling Technology | 2024S | |
| HK2抗体 | Cell Signaling Technology | 2867S | |
| MPC1抗体 | Cell Signaling Technology | 14462S | |
| MPC2抗体 | Cell Signaling Technology | 46141S | |
| 总PDH抗体 | Cell Signaling Technology | 3205S | |
| 磷酸化PDH E1 α S293抗体 | Abcam | ab92696 | |
| GLUT1抗体 | Abcam | ab115730 | |
| GLUT4抗体 | Abcam | ab33780 | |
| 总AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4961 | |
| 磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4058S | |
| 总S6抗体 | Cell Signaling Technology | 2217S | |
| 磷酸化S6 Ser235/236抗体 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| 抗小鼠IgG HRP偶联二抗 | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| 抗兔IgG HRP偶联二抗 | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| PDH活性测定 | PDH活性比色测定试剂盒 | Millipore Sigma | MAK183 |
| RNA-seq | Illumina TruSeq链式mRNA试剂盒 | Illumina | -- |
| Nugen Ovation扩增试剂盒 | Nugen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本采集 | 心脏麻痹液配方、冷缺血时间及样本储存条件 阅读提示：Methods: Sample procurement |
| 代谢组学分析 | 代谢物提取方案、LC-MS梯度、色谱柱和质谱参数 阅读提示：Methods: Metabolite extraction, Metabolite measurement by LC-MS, Lipid measurement by LC-MS |
| RNA-seq | RNA提取、文库制备、测序平台和数据归一化方法 阅读提示：Methods: RNA-seq |
| Western blot | 蛋白提取缓冲液、凝胶、抗体浓度和显影方法 阅读提示：Methods: Western blots and molecular assays |
| 动静脉梯度分析 | 患者纳入标准（EF分组）、采血部位和时间 阅读提示：Results: Figure 2e,4j,6e,7g描述 |