建立小鼠肿瘤模型并验证髓系特异性敲除效果
验证髓系细胞中SHP-2或PD-1缺失对肿瘤生长的影响。
使用Shp2f/fLysMCre和Pdcd1f/fLysMCre小鼠皮下接种B16-F10黑色素瘤或MC17-51纤维肉瘤细胞，监测肿瘤体积和重量，并与对照组比较。
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SHP-2和PD-1-SHP-2信号调控髓系细胞分化和抗肿瘤反应
SHP-2 and PD-1-SHP-2 signaling regulate myeloid cell differentiation and antitumor responses
实验完整度
高包含基因敲除小鼠模型、体外细胞培养与信号通路分析、RNA-seq转录组学、代谢组学、过继转移实验等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠B16-F10黑色素瘤模型 小鼠MC17-51纤维肉瘤模型 骨髓来源髓系细胞体外培养体系
重点核对
髓系特异性SHP-2敲除小鼠（Shp2f/fLysMCre）肿瘤生长显著减少 髓系特异性PD-1敲除小鼠（Pdcd1f/fLysMCre）肿瘤生长减少 GM-CSF诱导PD-1磷酸化并与SHP-2结合，且PD-1-SHP-2招募至GM-CSF受体 SHP-2或PD-1缺失增强GM-CSF介导的HOXA10和IRF8磷酸化 IL-10中和抗体处理可削弱Shp2f/fLysMCre和Pdcd1f/fLysMCre小鼠的抗肿瘤免疫
摘要
抑制性受体PD-1通过招募磷酸酶SHP-2抑制T细胞活化。然而，T细胞特异性缺失SHP-2的小鼠并未表现出改善的抗肿瘤免疫。在这里，我们显示在髓系细胞而非T细胞中条件性靶向SHP-2的小鼠肿瘤生长减少。RNA测序（RNA-seq）随后进行基因集富集分析表明存在多形核髓源性抑制细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），它们具有增强的分化、活化和免疫刺激分子表达的富集基因表达谱。在髓系细胞条件性靶向PD-1的小鼠中，同样表现出肿瘤生长减少，其TAMs的基因表达谱富集了髓系分化、活化和白细胞介导的免疫，与SHP-2缺陷型TAMs的富集谱有超过50%的重叠。在骨髓中，GM-CSF诱导PD-1磷酸化并将PD-1-SHP-2招募至GM-CSF受体。缺失SHP-2或PD-1增强了GM-CSF介导的转录因子HOXA10和IRF8的磷酸化，这些转录因子分别调节髓系分化和单核细胞-树突状细胞谱系定型。因此，SHP-2和PD-1-SHP-2信号限制了髓细胞分化，导致抑制抗肿瘤免疫的髓系景观。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PD-1-SHP-2信号在髓系细胞中的作用及其对肿瘤免疫的影响机制是什么？
- 核心机制
- SHP-2和PD-1-SHP-2信号通过限制GM-CSF介导的转录因子HOXA10和IRF8的磷酸化，抑制髓系细胞分化和单核细胞/树突状细胞谱系定型，导致免疫抑制性髓系细胞积累，从而抑制抗肿瘤免疫。
- 主要证据
- 在髓系细胞特异性敲除SHP-2或PD-1的小鼠中，肿瘤生长减少，肿瘤浸润的髓系细胞表现出分化增强、活化增加和免疫刺激分子表达上调；RNA-seq显示分化、活化和白细胞介导免疫相关基因富集；体外实验证实SHP-2或PD-1缺失增强GM-CSF介导的HOXA10和IRF8磷酸化。
- 研究意义
- 该研究揭示了PD-1-SHP-2轴在髓系细胞中的关键作用，为癌症免疫治疗提供了新的潜在靶点，可能通过靶向髓系细胞增强抗肿瘤免疫。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析髓系细胞的分化和功能变化
评估SHP-2或PD-1缺失后髓系细胞（MDSC、TAM）的分化、活化和免疫抑制功能。
通过流式细胞术分析肿瘤和脾脏中MDSC亚群（M-MDSC和PMN-MDSC）的比例、表面标志物（CD38、MHC II、CD86、IFN-γ）的表达，并通过抑制实验评估其免疫抑制能力。
转录组学分析髓系细胞的基因表达谱
揭示SHP-2或PD-1缺失对髓系细胞基因表达和通路的影响。
从肿瘤小鼠脾脏分离PMN-MDSC，从肿瘤中分离TAMs，进行RNA-seq，使用DESeq2进行差异表达分析，并使用GSEA和通路富集分析。
体外信号通路分析
阐明GM-CSF介导的PD-1-SHP-2信号对HOXA10和IRF8磷酸化的影响。
从野生型、Shp2f/fLysMCre和Pdcd1f/fLysMCre小鼠分离骨髓细胞，用GM-CSF和IL-3培养48小时，通过免疫沉淀和免疫印迹检测HOXA10、IRF8和PD-1的磷酸化及相互作用。
过继转移实验验证单核细胞的抗肿瘤能力
评估SHP-2或PD-1缺陷的单核细胞是否具有持久的抗肿瘤能力（训练免疫）。
从荷瘤小鼠骨髓中分离CD45+CD11b+Ly6ChiLy6G-单核细胞，与MC17-51肿瘤细胞混合后皮下注射到naïve野生型小鼠，监测肿瘤生长。
IL-10中和实验
验证IL-10在SHP-2或PD-1缺失介导的抗肿瘤免疫中的作用。
对WT、Shp2f/fLysMCre和Pdcd1f/fLysMCre小鼠接种MC17-51肿瘤，在第9、11、13天给予IL-10中和抗体或同型对照，监测肿瘤生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 流式细胞术 | BD LSRFortessa流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- |
| 贝克曼库尔特Cytoflex流式细胞仪 | Beckman-Coulter | -- | |
| 免疫印迹 | LI-COR Odyssey CLx成像系统 | Li-COR | -- |
| 细胞培养 | 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | -- |
| 白细胞介素-3 | Peprotech | -- | |
| 免疫抑制实验 | EasySep小鼠CD11b+GR1+分离试剂盒 | Stemcell Technologies | 19867 |
| MDSC分离试剂盒 | Miltenyi Biotech | 130-094-538 | |
| 3H-胸苷 | -- | -- | |
| RNA-seq | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| TruSeq链式mRNA文库制备试剂盒 | Illumina | 20020594 | |
| NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| 代谢组学 | 5500 QTRAP混合三重四极杆质谱仪 | AB/SCIEX | -- |
| MultiQuant 2.1软件 | AB/SCIEX | -- | |
| 实时荧光定量PCR | AB 7000实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- |
| 抗体处理 | InVivoMAb抗PD-1抗体（克隆RMPI-14） | BioXCell | -- |
| InVivoMAb抗IL-10抗体（克隆JES5-2A5） | BioXCell | -- | |
| InVivoMAb抗CD3ε抗体（克隆145-2C11） | BioXCell | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠肿瘤模型 | 小鼠品系和基因型（Shp2f/fLysMCre, Pdcd1f/fLysMCre）、肿瘤细胞系（B16-F10, MC17-51）、接种细胞数和途径、监测时间点 阅读提示：Methods: Tumor cell lines and tumor experiments; Fig. 1a, Fig. 3a |
| 流式细胞术 | 抗体克隆和荧光标记、染色条件和细胞固定/透化试剂 阅读提示：Methods: Cell purification and processing; Figure legends |
| 免疫抑制实验 | MDSC分离方法、OTI脾细胞数量、OVA257-264浓度、共培养时间和3H-胸苷加入时间 阅读提示：Methods: Suppression assay; Fig. 1e, Fig. 4a |
| RNA-seq | 细胞分选策略（PMN-MDSC, TAM）、RNA提取试剂盒、建库试剂盒、测序平台和reads长度、生物信息学分析流程和参数 阅读提示：Methods: RNA-seq and analysis; Fig. 4h, Fig. 5a |
| 信号通路实验 | 骨髓细胞培养条件（GM-CSF和IL-3浓度及时间）、GM-CSF刺激浓度和时间点、免疫沉淀和免疫印迹抗体及稀释比例 阅读提示：Methods: Cell culture and signaling; Immunoprecipitation and immunoblotting; Fig. 7 |
| 过继转移实验 | 供体小鼠肿瘤接种天数（9天）、单核细胞分离和分选、细胞与肿瘤细胞比例、注射途径、受体小鼠品系 阅读提示：Methods: Tumor cell lines and tumor experiments; Fig. 6 |
| 抗体处理实验 | 抗体种类、克隆号、剂量、给药时间和途径 阅读提示：Methods: Tumor cell lines and tumor experiments; Fig. 2, Extended Data Fig. 4, 10 |