体外HIV感染模型建立和验证
验证ASAPseq能否检测HIV感染的CD4+ T细胞。
从HIV阴性供体分离CD4+ T细胞，激活后感染HIV-1 SUMA株，培养后通过ASAPseq检测整合病毒DNA，并通过流式细胞术验证p24表达。
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HIV-1感染的CD4+ T细胞储存库的显著表型和表观遗传异质性
Profound phenotypic and epigenetic heterogeneity of the HIV-1-infected CD4+ T cell reservoir
实验完整度
高包括体外感染模型、未经治疗慢性感染淋巴结样本、ART治疗外周血样本，并使用ASAPseq结合流式、机器学习、表观遗传分析进行功能验证和机制研究。
主要模型
体外HIV感染CD4+ T细胞（SUMA株） 未治疗慢性HIV感染者淋巴结CD4+ T细胞 ART治疗HIV感染者外周血记忆CD4+ T细胞
重点核对
样本来源：HIV阴性供体PBMC、未治疗慢性感染者淋巴结、ART治疗者外周血 感染状态确认：通过整合原病毒DNA检测（hiv-haystack） 处理条件：体外激活（anti-CD3、anti-CD28/CD49d、IL-2）、HIV感染（SUMA株）、ART治疗状态 细胞分群：基于ATAC和ADT数据进行无监督聚类和手动注释 差异分析：使用DESeq2和Wilcoxon检验比较HIV+与HIV-细胞表面标志物和表观遗传特征
摘要
理解抗逆转录病毒治疗（ART）期间长期存在的HIV储存库的复杂性，仍然是实现HIV治愈研究的一大障碍。为了解决这一问题，我们开发了一种单细胞策略，通过整合的可及原病毒DNA的存在，结合表观遗传和细胞表面蛋白分析，精确定义ART治疗的HIV感染者（ART-PLWH）外周血中未受干扰的HIV感染记忆CD4+ T细胞储存库。我们发现ART-PLWH个体内部和个体之间储存库存在显著的异质性，其特征是总记忆CD4+ T细胞亚群和个体记忆CD4+ T细胞亚群中出现新的和已知的表面标志物。我们进一步发现了HIV感染细胞中富集的新的表观遗传特征和转录因子基序，这表明具有可及原病毒的感染细胞，无论储存库分布如何，在ART治疗期间都准备重新激活。总之，我们的发现揭示了HIV储存库广泛的人际和人际内细胞异质性，并建立了一个初步的多组学图谱，以制定靶向储存库清除策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HIV-1感染细胞在ART治疗下形成储存库的细胞表型和表观遗传特征是什么？
- 核心机制
- HIV感染细胞具有更高的激活状态，表现为AP-1家族转录因子基序的可及性增加，且可能通过CCR5等相关标志物影响感染倾向。
- 主要证据
- 通过ASAPseq在体外感染模型和患者样本中直接识别整合HIV DNA的CD4+ T细胞，结合表面蛋白和染色质可及性分析，发现HIV+细胞高表达CCR5、PD-1、CD2等激活标志物，并富集AP-1相关转录因子基序。
- 研究意义
- 建立了HIV感染细胞的多组学单细胞图谱，为设计靶向储存库的清除策略提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
未治疗慢性感染者淋巴结样本分析
评估自然感染状态下淋巴结中HIV感染细胞的表型和表观遗传特征。
从2名未治疗HIV感染者的淋巴结中富集记忆CD4+ T细胞，进行ASAPseq，分析HIV+细胞的表面标志物和染色质可及性。
ART治疗感染者外周血样本分析
评估ART抑制下HIV储存库的细胞组成和表型。
从4名ART治疗HIV感染者的外周血中富集记忆CD4+ T细胞，进行ASAPseq，分析HIV+细胞的多样性及其与病毒反弹的关系。
表面标志物和表观遗传差异分析
鉴定HIV感染细胞特有的表面蛋白和表观遗传特征。
对HIV+和HIV-细胞进行差异表达分析（DESeq2、Wilcoxon），并利用chromVAR和ArchR分析转录因子基序富集。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与处理 | RPMI培养基 | -- | -- |
| 白细胞介素-2 | Sigma Millipore | 11011456001 | |
| 抗CD3抗体 | Bio-Rad | MCA463EL | |
| 抗CD28/CD49d抗体 | BD | 347690 | |
| 细胞分离与富集 | EasySep人记忆CD4+ T细胞富集试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19157 |
| 流式细胞术 | Live/Dead可固定Aqua死细胞染料 | Invitrogen | -- |
| 抗p24 FITC抗体 | Beckman Coulter | 6604665 | |
| ASAPseq | TotalSeq-A人通用抗体混合物v1.0 | BioLegend | 399907 |
| TruStain FcX | BioLegend | 422302 | |
| OMNI裂解缓冲液 | -- | -- | |
| 细胞核缓冲液（10x Genomics） | 10x Genomics | -- | |
| scATACseq Chip H试剂盒 | 10x Genomics | -- | |
| FlowMi细胞过滤器 | Sigma | BAH136800040-50EA | |
| Qubit dsDNA HS检测试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 高灵敏度D1000 DNA胶带 | Agilent | -- | |
| 测序 | NextSeq 550 | Illumina | -- |
| NovaSeq 6000 | Illumina | -- | |
| MiSeq | Illumina | -- | |
| 流式细胞术 | BD FACS Symphony A5 | BD | -- |
| 细胞计数 | Countess II | Invitrogen | -- |
| 细胞分离 | 死细胞去除（Annexin V）试剂盒 | STEMCELL Technologies | 17899 |
| DNA提取 | QIAamp DNA Mini和Blood Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| PCR | Platinum Taq高保真聚合酶 | Life Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外感染模型 | CD4+ T细胞激活条件（anti-CD3、anti-CD28/CD49d、IL-2）及浓度；HIV-1 SUMA株感染剂量（50 ng p24）；培养时间。 阅读提示：Methods: In vitro infection model |
| ASAPseq实验 | 细胞数量（5×10^5-1×10^6）；抗体cocktail（TotalSeq-A Universal Cocktail）；桥接寡核苷酸（BOA）浓度；PCR循环数。 阅读提示：Methods: ASAPseq—cell preparation and staining, ASAPseq—library preparation |
| 数据分析和HIV检测 | 比对参考基因组（hg38+SUMA/HXB2/自体序列）；TSS富集度过滤阈值；hiv-haystack参数；差异表达和motif分析的统计方法及阈值。 阅读提示：Methods: Initial ATAC data processing, Initial ADT data processing, Identification of HIV+ cells, Downstream data processing |