变异感知脱靶预测工具CRISPRme的开发
开发一个能够整合遗传变异、支持单倍型和indel的脱靶预测工具。
开发了基于网络的CRISPRme工具，支持SNP、indel、单倍型、多个错配和bulge，并提供多种报告。
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人类遗传多样性改变治疗性基因编辑的脱靶结果
Human genetic diversity alters off-target outcomes of therapeutic gene editing
实验完整度
高包含计算工具开发、人群变异分析、细胞实验（CD34+ HSPCs编辑）、以及PCR、测序、ddPCR等多层级验证，并对高保真Cas9进行对比。
主要模型
人类CD34+造血干细胞和祖细胞（HSPCs）
重点核对
CD34+ HSPC供体rs114518452基因型（杂合或纯合参考） RNP电穿孔（3xNLS-SpCas9或HiFi-3xNLS-SpCas9，100 pmol蛋白，300 pmol sgRNA） 电穿孔后5天收集细胞 靶向和脱靶位点的扩增子测序覆盖深度（>18,000X脱靶，>3,800X靶向） 使用CRISPResso v2.1.0分析，缺口开放罚分-30
摘要
CRISPR基因编辑在修饰体细胞DNA序列以治疗疾病方面具有巨大潜力。然而，标准的计算和生化方法预测脱靶潜力时聚焦于参考基因组。我们开发了一个高效工具CRISPRme，它考虑SNP和indel遗传变异来提名和优先排序脱靶位点。我们用一个在镰状细胞病和β-地中海贫血临床试验中显示出前景的BCL11A增强子靶向引导RNA测试了该软件，发现排名最高的候选脱靶位点由非洲血统人群中常见的等位基因（MAF 4.5%）产生，该等位基因引入了一个前间隔区邻近基序（PAM）序列。我们验证了SpCas9在CD34+ HSPCs中产生严格等位基因特异性的插入缺失和着丝粒周围倒位，尽管高保真度Cas9减轻了这种脱靶效应。本报告说明遗传变异应被视为基因编辑结果的修饰因子。我们预期变异感知的脱靶评估将成为治疗性基因组编辑评估的组成部分，并为全面的脱靶提名提供强有力的方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 遗传变异是否会影响CRISPR基因编辑的脱靶潜力，并需要纳入治疗性评估？
- 核心机制
- 常见的遗传变异（如rs114518452-C）可创建新的PAM序列，从而产生等位基因特异性的脱靶位点，增加Cas9切割潜力。
- 主要证据
- 通过CRISPRme预测，并在来自非洲血统杂合供体的CD34+ HSPCs中验证，观察到等位基因特异性的插入缺失和着丝粒周围倒位；高保真Cas9（HiFi）显著减少脱靶。
- 研究意义
- 作者提出变异感知的脱靶评估应成为治疗性基因组编辑评估的组成部分，以识别被常规分析忽视的潜在脱靶。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
预测BCL11A增强子gRNA的脱靶位点
评估临床gRNA #1617的潜在脱靶，识别由遗传变异引入的高风险位点。
使用CRISPRme对gRNA #1617进行搜索，结合1000G和HGDP变异，分析候选脱靶的CFD分数和等位基因频率。
等位基因特异性脱靶的实验验证
验证预测的脱靶位点在原代细胞中是否发生等位基因特异性的编辑。
对来自非洲血统杂合供体的CD34+ HSPCs进行RNP电穿孔（SpCas9或HiFi），通过扩增子测序检测靶向和脱靶位点的插入缺失，并通过倒位PCR和ddPCR检测倒位。
评估其他gRNA和策略的等位基因特异脱靶
评估遗传变异引入的脱靶在多种治疗性gRNA和核酸靶向策略中的普遍性。
使用CRISPRme分析了13个SpCas9 gRNA和6个非SpCas9 gRNA，以及RNAi和ASO疗法（Nusinersen和Inclisiran），统计替代等位基因特异脱靶的比例和特征。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | CliniMACS CD34试剂 | Miltenyi | 130-017-501 |
| 干细胞生长培养基（SCGM） | CellGenix | 20806-0500 | |
| 人干细胞生长因子（SCF） | CellGenix | 1418-050 | |
| 人血小板生成素（TPO） | CellGenix | 1417-050 | |
| 重组人FMS样酪氨酸激酶3配体（Flt3-L） | CellGenix | 1415-050 | |
| IMDM培养基 | LIFE | 12440061 | |
| 全转铁蛋白 | Sigma | T0665-1G | |
| 重组人胰岛素 | Sigma | 19278-5ML | |
| 肝素 | Sigma | H3149 | |
| 促红细胞生成素 | Pharmacy | -- | |
| 蛋白质纯化 | pET21a表达质粒 | Addgene | 114365 |
| 大肠杆菌Rosetta (DE3) pLysS菌株 | Sigma-Aldrich | 70956 | |
| M-110s微流化器 | Microfluidics | -- | |
| HiTrap-S柱 | -- | -- | |
| Hiload 16/600 Superdex 200 pg柱 | -- | -- | |
| BL21 (DE3)感受态细胞 | MilliporeSigma | 702353 | |
| Benzonase核酸酶 | Novagen | 70664-3 | |
| Toxin Sensor显色LAL内毒素检测试剂盒 | GenScript | L00350 | |
| Amicon超滤管 - 30k NMWL | MilliporeSigma | UFC903008 | |
| Ultrafree-MC离心过滤器 | MilliporeSigma | UFC30GV0S | |
| TGX无染色4–20% SDS-PAGE凝胶 | Biorad | 5678093 | |
| 电穿孔 | Lonza 4D核转染仪 | Lonza | V4XP-3032 |
| sgRNA-1617 | IDT | -- | |
| 甘油 | Sigma | G2025 | |
| P3溶液 | Lonza | -- | |
| DNA提取和PCR | DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | 69506 |
| KOD热启动DNA聚合酶 | EMD-Millipore | 71086-31 | |
| 高灵敏度D1000试剂 | Agilent | 5067-5585 | |
| 高灵敏度D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | |
| KAPA通用qPCR预混液 | KAPA Biosystems | KK4824 | |
| Qubit dsDNA HS检测试剂盒 | Thermo Fisher | Q32854 | |
| 测序 | MiniSeq测序仪 | Illumina | -- |
| 测序分析 | Trimmomatic | -- | -- |
| CRISPResso2 | -- | -- | |
| 倒位PCR | 琼脂糖 | VWR | 97062-250 |
| BioRad ChemiDoc MP成像系统 | BioRad | -- | |
| 液滴数字PCR | ddPCR预混液（无dUTP） | Bio-Rad | 1863024 |
| 自动化液滴生成器 | Bio-Rad | 1864101 | |
| 探针用自动化液滴生成油 | Bio-Rad | 1864110 | |
| QX200液滴读取器 | Bio-Rad | 10031906 | |
| 软件 | QuantaSoft软件 | Bio-Rad | 10031906 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | CD34+ HSPC来源（供体1：Miltenyi Biotec；供体2-7：Fred Hutchinson Cancer Research Center），培养基成分（SCGM补充SCF、TPO、Flt3-L），电穿孔后转移至EDM（含转铁蛋白、胰岛素、肝素、人血浆AB和促红细胞生成素） 阅读提示：Methods - Cell culture |
| RNP电穿孔 | RNP复合物组成：100 pmol SpCas9蛋白或HiFi-3xNLS-SpCas9蛋白，300 pmol sgRNA-1617，甘油2%终浓度，P3溶液；电穿孔程序EO-100；细胞数量50K；电穿孔后恢复和培养条件 阅读提示：Methods - RNP electroporation |
| 靶向和脱靶编辑检测 | 引物序列（F1/R1用于靶向位点，F2/R2用于脱靶位点），PCR循环条件，扩增子测序覆盖深度（脱靶>18,000X，靶向>3,800X），分析参数（CRISPResso2，缺口开放罚分-30，只计算PAM上游3bp的indels） 阅读提示：Methods - Measurement of +58 BCL11A enhancer on-target and OT40 off-target indel and inversion |
| 倒位PCR | 嵌套PCR引物和循环条件（30个循环），凝胶电泳条件（2%琼脂糖） 阅读提示：Methods - Inversion PCR |
| ddPCR | DNA量（100 ng），引物和探针序列（见补充表5），循环条件，QX200 Droplet Reader设置 阅读提示：Methods - Droplet digital PCR |