多组学数据收集与质控
建立PDAC的蛋白质基因组学图谱
收集229例PDAC患者的肿瘤及邻近组织样本，进行全外显子测序、RNA-seq、蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析；通过病理评估和计算算法评估肿瘤纯度。
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胰腺导管腺癌生物学与治疗的蛋白质基因组学见解
Proteogenomic insights into the biology and treatment of pancreatic ductal adenocarcinoma
实验完整度
高包含多组学分析（WES、RNA-seq、蛋白质组、磷酸化蛋白质组）、体外功能实验（细胞增殖、迁移、糖酵解测定）、体内异种移植实验及免疫组化验证，多重证据层级支持主要结论。
主要模型
PANC-1细胞系 SW1990细胞系 BxPC-3细胞系 BALB/c裸鼠异种移植模型
重点核对
TP53突变状态与患者年龄分组（≤60岁 vs >60岁） ADAM9扩增状态与转移表型 FH扩增状态与血糖水平及免疫浸润 HOGA1表达水平与LARP7-CDK1通路活性 细胞培养条件（高糖/低糖）
摘要
背景：胰腺导管腺癌（PDAC）是一种预后不良的毁灭性疾病。蛋白质基因组学表征和整合蛋白质组学分析为注释具有预后价值的基因组异常提供了功能背景。方法：我们对217例PDAC肿瘤及其配对非肿瘤邻近组织进行了整合多组学分析，包括全外显子组测序、RNA-seq、蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析。进行了体内功能实验以进一步阐明与PDAC肿瘤发生和进展相关的生物学事件。结果：全面的蛋白质基因组学图谱显示，TP53突变上调了CDK4介导的细胞增殖过程，并导致年轻患者预后不良。整合多组学分析阐明了由基因组改变（如KRAS突变和ADAM9扩增）引起的蛋白质组和磷酸化蛋白质组改变对PDAC肿瘤发生的影响。蛋白质基因组学分析与体内实验相结合表明，ADAM9（8p11.22）的较高扩增频率可通过下调黏附连接和上调WNT信号通路驱动PDAC转移。基于蛋白质组的PDAC分层揭示了与不同临床和分子特征相关的三种亚型（S-I、S-II和S-III）。免疫聚类定义了一个代谢性肿瘤亚群，该亚群携带FH扩增，预后较好。功能实验揭示了FH在改变肿瘤糖酵解和影响PDAC肿瘤微环境中的作用。利用体内和体外实验证明，HOGA1缺失通过激活LARP7-CDK1通路促进肿瘤生长。结论：该蛋白质基因组学数据集为寻求更好理解和治疗PDAC的研究人员和临床医生提供了宝贵的资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过蛋白质基因组学整合分析揭示PDAC的分子特征、预后标志物和治疗靶点？
- 核心机制
- TP53突变通过上调CDK4介导的细胞增殖导致年轻患者预后不良；ADAM9扩增通过下调黏附连接和上调WNT信号通路促进转移；FH扩增通过增强TCA循环和葡萄糖转运改善预后；HOGA1缺失通过激活LARP7-CDK1通路促进肿瘤生长。
- 主要证据
- 基于217例PDAC样本的多组学数据（WES、RNA-seq、蛋白质组、磷酸化蛋白质组），结合细胞系功能实验（如transwell迁移实验、细胞增殖实验）和体内异种移植实验。
- 研究意义
- 提供了PDAC的蛋白质基因组学资源，揭示了潜在的诊断和治疗靶点（如HOGA1），为PDAC的个体化治疗提供了新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基因组变异分析
鉴定PDAC中显著突变的基因和拷贝数改变
利用WES数据识别体细胞突变和拷贝数改变，使用GISTIC2分析，并与已知PDAC队列比较。
蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析
表征肿瘤与正常组织间的蛋白质和磷酸化变化
对肿瘤和NAT进行蛋白质组和磷酸化蛋白质组定量，进行差异表达分析、通路富集分析，并整合转录组数据。
功能验证（ADAM9）
验证ADAM9扩增对PDAC转移的影响
在PANC-1细胞中敲低ADAM9，进行transwell迁移实验，并进行蛋白质组分析、免疫共沉淀实验。
功能验证（FH）
验证FH扩增对肿瘤代谢和免疫微环境的影响
在SW1990和PANC-1细胞中敲低FH，检测细胞增殖、糖酵解速率、葡萄糖摄取、代谢物水平，并分析培养上清中细胞因子。
功能验证（HOGA1）
验证HOGA1缺失对肿瘤生长的影响及其机制
在PANC-1和BxPC-3细胞中过表达或敲低HOGA1，检测细胞增殖、细胞周期、蛋白质相互作用、泛素化水平，并进行异种移植实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 全外显子测序 | QIAamp DNA Mini Kit | QIAGEN | -- |
| Qubit® DNA检测试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| Agilent SureSelect人全外显子试剂盒 | Agilent Technologies | -- | |
| 文库制备 | AMPure XP系统 | Beckman Coulter | -- |
| RNA提取 | TIANGEN® RNAprep Pure FFPE试剂盒 | TIANGEN | DP439 |
| RNA-seq文库构建 | Ribo-off® rRNA去除试剂盒（H/M/R） | Vazyme | N406 |
| VAHTS® Universal V6 RNA-seq文库制备试剂盒（Illumina） | Vazyme | N401-NR604 | |
| 蛋白质提取 | 二硫苏糖醇 | Sigma | 43,815 |
| 蛋白质消化 | Microcon过滤管 | Sartorius | -- |
| 磷酸化肽段富集 | High-Select™ Fe-NTA磷酸化肽段富集试剂盒 | Thermo Scientific | A32992 |
| LC-MS/MS分析 | Q Exactive HFX质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Easy-nLC 1200液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 磷酸化蛋白质组学分析 | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| FAIMS接口 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Easy nLC-1000液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 质谱数据质控 | HEK293T细胞 | -- | -- |
| 免疫组织化学 | Leica BOND-MAX自动染色系统 | Roche | -- |
| Bond Polymer Refine检测系统DS9800 | Bond | -- | |
| OLYMPUS BX43显微镜 | OLYMPUS | -- | |
| ImageScope | Leica | -- | |
| Western blotting | 增强化学发光蛋白检测试剂盒 | Pierce Biotechnology; Thermo Fisher Scientific | -- |
| 葡萄糖摄取检测 | 葡萄糖摄取检测试剂盒 | Promega | J1342 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | HyClone; GE Healthcare Life Science | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000 | Invitrogen | -- |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | -- | |
| 聚乙烯亚胺 | -- | -- | |
| 免疫共沉淀 | Flag磁珠 | Sigma | -- |
| 抗ADAM9抗体 | Abcam | ab186833 | |
| SBP磁珠 | Millipore | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK8试剂 | -- | -- |
| 流式分析 | 碘化丙啶 | -- | -- |
| RT-qPCR | Superscript III逆转录试剂盒 | Invitrogen | -- |
| SYBR green | -- | -- | |
| 代谢物检测 | Q Executive HFX质谱仪 | Thermo Fisher | -- |
| 岛津HPLC系统（LC 20AB） | Shimadzu | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集与病理评估 | 肿瘤纯度、组织学类型、分级、TNM分期 阅读提示：Methods: Sample selection, Tumor purity; Additional file 23: Table S1 |
| 全外显子测序 | 测序深度（肿瘤179X，正常149X）、变异过滤条件 阅读提示：Methods: Whole-exome sequencing, Genomic variant calling |
| 蛋白质组学 | 样本制备（FFPE）、酶解条件、LC-MS/MS参数 阅读提示：Methods: Protein extraction and tryptic digestion, LC–MS/MS analysis |
| 磷酸化蛋白质组学 | 磷酸化肽段富集方法、质谱参数（FAIMS CV） 阅读提示：Methods: Phosphopeptide enrichment, LC–MS/MS analysis |
| 细胞功能实验（ADAM9） | 细胞系（PANC-1）、siRNA序列、转染方法、transwell条件 阅读提示：Methods: Cell culture, Cell transfections, Transwell migration assays; Additional file 9: Fig. S9A |
| 细胞功能实验（FH） | 细胞系（SW1990, PANC-1）、siRNA、葡萄糖条件、检测方法 阅读提示：Methods: Cell culture, Cell transfections, Glycolytic rate assays, Glucose uptake assay; Additional file 17: Fig. S17D-H |
| 细胞功能实验（HOGA1） | 细胞系（PANC-1, BxPC-3）、质粒、siRNA、异种移植条件 阅读提示：Methods: Cell culture, Plasmids, Cell transfections, Xenograft tumorigenesis experiments; Additional file 20-21 |