筛选胆碱能刺激下CAF上调的轴突导向分子
确定胆碱能刺激是否调节CAF中轴突导向分子或神经营养因子的表达。
用乙酰胆碱（ACh）处理人结肠CAF05细胞，通过qRT-PCR检测轴突导向分子和神经营养因子表达。
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自放大的神经-成纤维细胞回路驱动结直肠癌进展
A self-amplifying nerve-fibroblast circuit drives colorectal cancer progression.
实验完整度
高包含体外细胞系、原代CAF、类器官、多种基因工程小鼠模型及患者样本，并有功能验证（敲除/激活、抗体阻断）和机制验证（CUT&RUN、报告基因、信号通路）。
主要模型
人结肠CAF05原代细胞 小鼠AKP结直肠癌类器官（ApcΔ/Δ;KrasG12D/Δ;Trp53Δ/Δ） AKP类器官直肠原位移植小鼠模型 Cdx2-CreERT2;Apcfl/fl;KrasG12D自发肠癌小鼠模型
重点核对
AKP类器官直肠原位移植：每只小鼠注射5×10^5个细胞，溶于50 μL含10% Cultrex BME type II的PBS中 C21瘤内注射剂量：0.03 mg/kg，每日一次，从移植后第8天开始 Darifenacin给药：3 mg/kg，通过渗透泵皮下植入，从移植后第8天开始 NTN1中和抗体（NP137）：10 mg/kg，腹腔注射，每2天一次 体外ACh处理浓度：100 μM，处理24小时（qRT-PCR）或20分钟（Western blot）
摘要
神经和癌症相关成纤维细胞（CAF）各自已被证明可直接调控癌症进展。然而，这些细胞是否相互作用以控制肿瘤进展在很大程度上仍不清楚。我们发现，在结直肠癌（CRC）中，胆碱能刺激诱导CAF以CHRM3/Gq依赖的方式分泌NTN1，进而增强瘤内胆碱能神经支配。在这个前馈回路中，胆碱能刺激通过肿瘤细胞CHRM3/Gq介导的YAP激活直接促进CRC生长，而CAF来源的NTN1通过UNC5B-PI3K/AKT信号促进CRC生长和上皮-间质转化样程序。化学遗传学激活胆碱能神经元或成纤维细胞激活M3受体/Gq可促进肿瘤YAP和AKT信号传导及CRC进展。相反，阻断CHRM3或NTN1可抑制这些通路并改善小鼠生存。在人类CRC中，高NTN1表达与间质样亚型和患者不良预后相关。这些发现表明，神经-间质相互作用是CRC进展的核心，并可通过CHRM3拮抗剂或NTN1阻断抗体进行靶向治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 胆碱能神经与癌症相关成纤维细胞（CAF）之间是否存在相互作用，以及该相互作用如何驱动结直肠癌（CRC）进展。
- 核心机制
- 胆碱能刺激通过CAF的CHRM3/Gq-PLC-Ca2+-LATS-YAP/TEAD轴上调NTN1分泌，NTN1进而增强胆碱能神经支配，形成前馈回路；同时，ACh通过肿瘤细胞CHRM3/Gq-YAP直接促进CRC生长，CAF来源的NTN1通过UNC5B-PI3K/AKT促进CRC生长和EMT样程序。
- 主要证据
- 体外使用CAF05细胞、AKP类器官和HT-29细胞验证信号通路；体内通过Lepr-Cre;Chrm3fl/fl、Lepr-Cre;LSL-hM3Dq、Ntn1fl/fl、Chat-Cre;LSL-hM3Dq、Chat-Cre;R26-iDTR等小鼠模型以及darifenacin和NTN1中和抗体治疗，证明阻断CHRM3或NTN1可抑制肿瘤生长并延长生存；人类CRC数据表明高NTN1表达与不良预后相关。
- 研究意义
- 揭示了神经-间质相互作用在CRC进展中的核心作用，提示靶向CHRM3或NTN1（如使用CHRM3拮抗剂darifenacin或NTN1阻断抗体）可能成为CRC的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证CHRM3/Gq-YAP轴调控CAF中NTN1表达
阐明胆碱能刺激上调CAF中NTN1的分子机制。
使用药理学抑制剂（scopolamine、darifenacin、FR900359、verteporfin）、CRISPR敲除CHRM3、Western blot检测LATS/YAP磷酸化、TEAD报告基因、CUT&RUN、NTN1上游序列报告基因和TEAD结合基序缺失实验。
验证CAF来源NTN1促进胆碱能神经轴突生长
确定胆碱能刺激的CAF条件培养基是否能促进胆碱能神经元轴突生长。
用bethanechol处理的CAF05条件培养基处理Chat-GFP小鼠肠神经，评估神经突生长；使用NTN1中和抗体、CHRM3或NTN1敲除CAF。
体内验证成纤维细胞Chrm3/Ntn1对肿瘤进展和神经支配的影响
确定成纤维细胞Chrm3和Ntn1在CRC进展及胆碱能神经支配中的作用。
在AKP原位移植模型中，使用Lepr-Cre;Chrm3fl/fl小鼠、Lepr-Cre;LSL-hM3Dq小鼠（联合Ntn1fl/fl），通过生存分析、IVIS检测肿瘤生长、免疫荧光检测YAP活化、NTN1表达和VAChT+神经密度。
验证胆碱能刺激通过肿瘤细胞CHRM3/Gq-YAP直接促进CRC生长
确定胆碱能信号是否直接作用于肿瘤细胞促进生长。
用ACh或bethanechol处理AKP类器官和HT-29/LS174T细胞，检测细胞生长、YAP报告基因活性、LATS/YAP磷酸化；使用CHRM3敲除或药理学抑制剂。
体内验证胆碱能神经元激活通过肿瘤细胞Chrm3促进CRC进展
确定化学遗传学激活胆碱能神经元是否通过肿瘤细胞Chrm3促进肿瘤生长。
将Chrm3-WT或Chrm3-KO AKP类器官移植到Chat-Cre;LSL-hM3Dq小鼠直肠，瘤内注射C21，评估生存、肿瘤生长和YAP活化。
验证NTN1通过UNC5B-PI3K/AKT促进CRC细胞生长和EMT样程序
确定CAF来源NTN1对CRC细胞的直接作用及下游信号通路。
用bethanechol处理的CAF条件培养基或重组NTN1处理HT-29和AKP细胞，检测细胞生长、AKT磷酸化、侵袭和EMT标志物；使用UNC5B敲除、NTN1中和抗体、PI3K/AKT抑制剂。
体内验证NTN1-UNC5B-AKT轴对肿瘤AKT活化和EMT的影响
确定成纤维细胞Ntn1和胆碱能神经支配对肿瘤AKT磷酸化和EMT样特征的影响。
在Lepr-Cre;LSL-hM3Dq、Ntn1fl/fl、Lepr-Cre;Chrm3fl/fl、Chat-Cre;LSL-hM3Dq和Chat-Cre;R26-iDTR小鼠模型中，通过免疫荧光检测肿瘤细胞磷酸化AKT、VIM表达和肿瘤出芽。
评估CHRM3或NTN1阻断的治疗效果
确定药理学阻断CHRM3或NTN1是否能抑制CRC进展。
在AKP原位模型和Cdx2-CreERT2;Apcfl/fl;KrasG12D模型中，使用darifenacin或NTN1中和抗体治疗，评估生存、肿瘤生长、YAP/AKT活化和EMT标志物。
分析人类CRC中NTN1表达与预后及信号通路的关系
确定NTN1表达与患者生存、分子亚型及YAP/AKT通路活化的关联。
分析TCGA和整合微阵列数据中NTN1表达与生存的关系，以及NTN1高表达肿瘤的基因集富集和免疫组化相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Advanced Dulbecco改良Eagle培养基/F12 | Life Technologies | -- |
| 胎牛血清 | GeminiBio | 900-108 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | -- | |
| 抗真菌/抗生素 | Life Technologies | -- | |
| 类器官培养 | Cultrex BME Type II | R&D Systems | 3532-005-02 |
| B27添加剂 | Life Technologies | -- | |
| N2添加剂 | Life Technologies | -- | |
| 小鼠重组Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| 药物处理 | 乙酰胆碱 | Selleck Chemicals | S1805 |
| 氯贝胆碱 | MedChemExpress | HY-B0406A | |
| 达非那新 | MedChemExpress | HY-A0012 | |
| FR900359 | Cayman Chemical | 33666 | |
| 维替泊芬 | MedChemExpress | HY-B0146 | |
| 重组人NTN1 | R&D Systems | 6419-N1-025 | |
| 库潘尼西 | MedChemExpress | HY-15346 | |
| 动物实验 | 化合物21 | MedChemExpress | HY-100234A |
| 白喉毒素 | Millipore Sigma | 322326 | |
| NTN1中和抗体 | Netris Pharma | -- | |
| 同型对照抗体 | Syd Labs | PA007125 | |
| 他莫昔芬 | Sigma | T5648 | |
| D-荧光素 | GoldBio | LUCK | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| RNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| qScript cDNA SuperMix | Quantabio | -- | |
| SYBR Green Fastmix | Quantabio | 95074 | |
| Western blot | XCell SureLock Mini-Cell电泳系统 | Invitrogen | -- |
| PVDF膜 | Millipore | IEVH07850 | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫组化/免疫荧光 | Alexa Fluor Plus 488/555/647标记二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| FlexAble 2.0 CoraLite Plus抗体标记试剂盒 | Proteintech | KFA501, KFA502, KFA503 | |
| Vectashield Plus抗淬灭封片剂 | Vector Laboratories | H-1900-2 | |
| 倒置荧光显微镜BZ-X710 | Keyence | -- | |
| ELISA | 人NTN1 ELISA试剂盒 | MyBioSource.com | MBS725887 |
| 乙酰胆碱ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-0081 | |
| CUT&RUN | EpiNext CUT&RUN快速试剂盒 | Epigentek | P-2028 |
| TEAD4抗体 | Abnova | H00007004-M01 | |
| 钙成像 | Calbryte 520 AM | AAT Bioquest | 20651 |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| FluoroBrite DMEM | Gibco | A1896701 | |
| 流式分析 | 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-101 |
| 抗生物素微珠 | Miltenyi Biotec | 130-097-046 | |
| 生物素标记EpCAM抗体 | Miltenyi Biotec | 130-117-862 | |
| RNA-seq | 2100生物分析仪 | Agilent | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AKP类器官直肠原位移植 | 细胞数量（5×10^5/注射）、注射体积（50 μL）、基质胶浓度（10% Cultrex BME type II）、小鼠周龄（8-12周）、性别（仅雄性） 阅读提示：STAR Methods中“Mice”小节及Figure 1E图注 |
| C21瘤内注射激活hM3Dq | 剂量（0.03 mg/kg）、频率（每日一次）、起始时间（移植后第8天）、注射体积（10 μL）、溶剂（DPBS） 阅读提示：STAR Methods中“In vivo activation of hM3Dq DREADD by C21”小节及Figure 3G、4F图注 |
| Darifenacin治疗 | 剂量（3 mg/kg）、给药方式（渗透泵皮下植入）、起始时间（移植后第8天）、溶剂（50% DMSO in PBS） 阅读提示：STAR Methods中“In vivo treatment with a NTN1 Ab or darifenacin”小节及Figure 6A图注 |
| NTN1中和抗体治疗 | 剂量（10 mg/kg）、给药方式（腹腔注射）、频率（每2天一次）、起始时间（移植后第8天） 阅读提示：STAR Methods中“In vivo treatment with a NTN1 Ab or darifenacin”小节及Figure 6G图注 |
| 体外ACh/bethanechol处理 | 浓度（ACh 100 μM，bethanechol 10 μM）、处理时间（qRT-PCR 24小时，Western blot 20分钟）、培养基（无血清FreeStyle 293表达培养基用于ACh实验） 阅读提示：STAR Methods中“Drugs used for in vitro studies”和“Quantitative reverse-transcription PCR”小节 |
| 条件培养基实验 | CAF05处理时间（72小时）、超滤浓缩倍数（100倍）、重悬稀释度（1:100）、肠神经培养时间（9天） 阅读提示：STAR Methods中“Conditioned medium experiments”小节 |