多组学队列构建与蛋白质组亚型划分
刻画髓母细胞瘤的多层分子特征并识别蛋白质组亚型
对384例冻存原发肿瘤样本进行甲基化组、转录组、蛋白质组、磷酸化蛋白质组和代谢组检测，采用共识聚类、SNF和MOFA划分亚型
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多组学整合揭示致死性第3组髓母细胞瘤内脂质依赖的肿瘤异质性
Multiomic integration reveals tumoral heterogeneity of lipid dependence within lethal group 3 medulloblastoma.
实验完整度
高384例患者样本五层组学整合，结合细胞系、PDX体外功能验证及小鼠原位移植瘤体内验证
主要模型
384例原发性髓母细胞瘤患者冻存肿瘤样本 第3组髓母细胞瘤细胞系（HD-MB03、MED8A、ONS76、D425等） 患者来源异种移植模型（PDX4、PDX7、PDX12等） nu/nu及NSG小鼠原位移植瘤模型
重点核对
G3p_a与非G3p_a亚型间差异代谢物及脂质物种的丰度比较 MYC过表达或敲低对FASN、SCD表达及脂滴含量的影响 FASN或SCD基因沉默及抑制剂处理后的细胞增殖与脂肪酸摄取 DGAT1基因敲低或抑制剂处理对脂滴、脂质过氧化及线粒体OCR的影响 小鼠原位移植后DGAT1敲低对生存期及肿瘤生长的影响
摘要
髓母细胞瘤是儿童中最常见的恶性脑肿瘤，表现出显著的生物学复杂性，需要更深入的探索。本文报道了一个大型多组学数据集，整合了384例原发性髓母细胞瘤患者样本的五个组学层面：CpG甲基化组、转录组、蛋白质组、磷酸化蛋白质组和代谢组，并配对相关的临床元数据。数据整合揭示了蛋白质组亚型之间脂质代谢的肿瘤间异质性。值得注意的是，虽然MYC-FASN-SCD轴驱动脂质生物合成，但通路抑制在体内通过外源性脂肪酸摄取引发代偿性逃逸机制。出乎意料的是，我们证明MYC触发脂质储存，产生对脂滴-线粒体通讯的独特依赖，以在体内维持肿瘤。总之，这项综合分析揭示了MYC下游的一个可靶向脆弱性，构成了治疗目前无法治疗的髓母细胞瘤亚型的有前景的治疗方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 第3组髓母细胞瘤内部存在何种肿瘤间代谢异质性，MYC驱动的脂质代谢是否构成可靶向的治疗脆弱性。
- 核心机制
- MYC通过FASN-SCD轴驱动从头脂质合成并促进外源脂肪酸摄取，将过量脂肪酸以甘油三酯形式储存于脂滴；脂滴通过与线粒体接触为β-氧化和氧化磷酸化提供底物，同时隔离细胞毒性多不饱和脂肪酸以避免脂质过氧化和铁死亡。
- 主要证据
- 384例样本五层多组学及COSMOS整合确定G3p_a亚型；细胞系和PDX中遗传与药物抑制FASN、SCD、DGAT1及PLIN5验证脂滴功能；MALDI-MSI、脂质组学、Seahorse OCR、TEM和FACS检测脂质与线粒体表型；小鼠原位移植模型验证DGAT1敲低延长生存期。
- 研究意义
- 揭示MYC下游脂滴储存是当前难以治疗的高危第3组髓母细胞瘤亚型的可靶向代谢脆弱性，并提示DGAT1抑制与化疗联合的临床前开发方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
代谢组与脂质组刻画亚型脂质特征
确定各亚型尤其是G3p_a的代谢与脂质特征
非靶向LC-MS代谢组分析、UMAP聚类、ANOVA差异代谢物分析及非靶向脂质组分析
COSMOS因果网络整合
推断G3p_a中转录因子、激酶、代谢酶与代谢物之间的机制联系
整合转录组、蛋白质组、磷酸化蛋白质组和代谢组，计算TF与激酶活性并运行COSMOS/CARNIVAL网络
MYC-FASN-SCD轴体外功能验证
验证MYC调控从头脂质合成并影响G3^MYCHigh细胞生长
在G3细胞系和PDX中过表达或敲低MYC，shRNA或抑制剂抑制FASN、SCD，检测增殖、活力及脂肪酸摄取
脂滴形成与脂滴-线粒体通讯验证
验证MYC诱导脂滴储存并支持线粒体脂肪酸氧化
Oil red O、LipidSpot、FACS和SIM/TEM检测脂滴及接触位点，Seahorse检测OCR，PLIN5敲低评估LD-Mt偶联
DGAT1依赖与铁死亡机制验证
验证脂滴储存经DGAT1保护细胞免于脂质过氧化和铁死亡
DGAT1 shRNA或A922500抑制，检测脂滴、脂质过氧化、线粒体膜电位、OCR及Fer-1和Erastin干预
体内原位移植瘤验证
在体内验证DGAT1抑制对MYC驱动肿瘤维持的作用
HD-MB03、D425细胞及PDX7原位注射nu/nu或NSG小鼠，监测生存期、生物发光成像及肿瘤指标
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | 41965–039 |
| 胎牛血清 | Merck | F9665 | |
| 青霉素/链霉素 | Merck | P4333 | |
| RPMI1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | |
| PDX培养 | Neurobasal培养基 | Gibco | 21103–049 |
| 人碱性成纤维细胞生长因子 | Peprotech | AF-100–188-1MG | |
| 人表皮生长因子 | Peprotech | AF-100–15-1MG | |
| 药物处理 | A922500（DGAT1抑制剂） | MedChemExpress | HY-10038 |
| PF-06424439（DGAT2抑制剂） | MedChemExpress | HY-108341A | |
| 铁抑素1 | MedChemExpress | HY-100579 | |
| TVB2640（FASN抑制剂） | MedChemExpress | HY-112829 | |
| BI99179（FASN抑制剂） | MedChemExpress | HY-16100 | |
| CAY10566（SCD抑制剂） | MedChemExpress | HY-15823 | |
| SMS121（CD36抑制剂） | MedChemExpress | HY-163541 | |
| 乙莫克舍 | MedChemExpress | HY-50202 | |
| Erastin | MedChemExpress | HY-15763 | |
| 环磷酰胺 | Selleckchem | S2057 | |
| 脂肪酸处理 | BSA-棕榈酸饱和脂肪酸复合物（5 mM） | Interchim | 29558 |
| BSA-油酸单不饱和脂肪酸复合物（5 mM） | Interchim | 29557 | |
| BSA-亚油酸ω-6多不饱和脂肪酸复合物 | Interchim | 38649 | |
| Western blot | 兔多克隆抗FASN抗体 | Proteintech | 10624–2-1AP |
| 兔多克隆抗SCD抗体 | Proteintech | 28678–1-AP | |
| 兔单克隆抗DGAT1抗体 | Abcam | ab181180 | |
| 兔多克隆抗PLIN5抗体 | Proteintech | 26951–1-AP | |
| 兔多克隆抗CD36抗体 | Proteintech | 18836–1-AP | |
| 兔多克隆抗CPT1A抗体 | Proteintech | 15184–1-AP | |
| 总OXPHOS人Western blot抗体混合物 | Abcam | ab-110411 | |
| 兔单克隆抗MYC抗体（D84C12） | CST | 5605 | |
| 脂滴检测 | LipidSpot™ 488脂滴染料 | Biotium | 70065 |
| LipidSpot™ 610脂滴染料 | Biotium | 70069 | |
| 油红O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| 脂肪酸摄取 | BODIPY™ FL C16脂肪酸探针 | Thermo Fisher Scientific | D3821 |
| 脂肪酸追踪 | BODIPY™ 558/568 C12脂肪酸探针 | Thermo Fisher Scientific | D3835 |
| 线粒体检测 | MitoTracker™绿色荧光探针 | Invitrogen | M46750 |
| MitoTracker™深红色荧光探针 | Invitrogen | M22426 | |
| 线粒体膜电位检测 | 流式细胞术MitoProbe™ TMRM试剂盒 | Invitrogen | M20036 |
| 脂质过氧化检测 | Image-iT™脂质过氧化检测试剂盒 | Invitrogen | C10445 |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo 3D细胞活力检测试剂盒 | Promega | G9682 |
| 线粒体呼吸检测 | Seahorse细胞线粒体应激检测试剂盒 | Agilent | 103015–100 |
| 脂肪酸氧化检测 | XF棕榈酸氧化应激高级检测试剂盒 | Agilent | 103672–100 |
| 线粒体呼吸检测 | FCCP解偶联剂 | Sigma-Aldrich | C2920 |
| 寡霉素 | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| 核酸提取 | DNeasy血液与组织DNA提取试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| RNeasy Plus迷你RNA提取试剂盒 | Qiagen | 74134 | |
| RNA测序 | TruSeq链特异性RNA LT文库构建试剂盒 | Illumina | -- |
| RT-qPCR | SuperScript™ III第一链合成预混液 | Invitrogen | 11752050 |
| Power SYBR™ Green PCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | |
| 转染 | X-tremeGENE™ 9 DNA转染试剂 | Sigma-Aldrich | XTG9-RO/6365787001 |
| 免疫组化 | DAB显色底物 | VectorLabs | SK-4100 |
| 体内成像 | D-荧光素钾盐生物发光底物 | Revvity | 122799 |
| 原位注射 | 基质胶 | Corning | 354230 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 多组学队列与亚型划分 | 各层面样本量：甲基化组369、转录组341、蛋白质组343、磷酸化蛋白质组264、代谢组170；临床注释376例 阅读提示：Results第一部分与Figure 1A图注；Table S1 |
| 非靶向脂质组分析 | 各组样本量SHHp_a=5、G3p_a=5、G3p_c=5；差异脂质统计阈值 阅读提示：Figure 2F图注及Methods中Untargeted lipidomic profiling |
| MYC-FASN-SCD轴细胞实验 | 细胞系HD-MB03、MED8A、ONS76的MYC状态；shRNA处理72 h；抑制剂浓度TVB2640/BI99179 10 μM、CAY10566 10 μM，处理48 h 阅读提示：Figure 4E–4H图注及Methods中Compounds and antibodies；Table S3 |
| 脂肪酸处理实验 | 油酸250 μM处理48 h；无脂肪酸BSA培养基条件 阅读提示：Figure 4K图注及Methods中Compounds and antibodies |
| DGAT1抑制与铁死亡实验 | A922500 10 μM（或0–100 μM）处理48 h；Fer-1 1 μM；Erastin 0–5 μM；MTMP/OCR检测 阅读提示：Figure 6图注及Methods中Compounds and antibodies、Oxygen consumption rate |
| 体内原位移植实验 | 细胞接种量HD-MB03 1×10^4、D425 1×10^4、PDX 1×10^6；小鼠品系nu/nu或NSG；每组n=5–8 阅读提示：Figure 7图注及Methods中In vivo cranial injection、Animal Husbandry |
| PLIN5与脂滴-线粒体接触实验 | PLIN5 shRNA；TEM和SIM量化细胞数（>50个细胞）；LD-Mt接触判定标准 阅读提示：Figure S6及Figure 5L–5M图注、Methods中Immunofluorescence与Transmission electron microscopy |