建立奥希替尼耐药细胞模型并鉴定耐药表型
获得亲本与耐药配对细胞系，确认耐药程度并排除靶基因新发突变作为主要耐药机制。
通过逐步增加奥希替尼浓度或持续暴露于奥希替尼/吉非替尼，生成PC9、H1975、HCC827、HCC4006等耐药细胞系；进行剂量反应曲线、外显子测序和RNA-seq。
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哺乳动物SWI/SNF染色质重塑复合物促进EGFR突变肺癌对酪氨酸激酶抑制剂的耐药
Mammalian SWI/SNF chromatin remodeling complexes promote tyrosine kinase inhibitor resistance in EGFR-mutant lung cancer.
实验完整度
高包含多对耐药细胞系、患者来源类器官/细胞及PDX体内模型，并行RNA-seq、ATAC-seq、CUT&RUN及遗传与药理功能验证
主要模型
PC9及其奥希替尼耐药PC9-OR细胞系 H1975、HCC827及其奥希替尼耐药细胞系 YU-005C细胞系及YU-005患者来源异种移植瘤模型 EGFR突变肺癌组织芯片及PDX
重点核对
耐药细胞系与亲本细胞系的奥希替尼EC50差异（耐药株>90倍） SMARCA4敲低后PC9-OR细胞在奥希替尼处理下的增殖和EC50变化 YU-005C异种移植瘤中SMARCA4敲除联合奥希替尼的肿瘤体积变化 Cmp14或FHD-286联合奥希替尼的Bliss协同评分和IC50变化 SMARCA4敲低或Cmp14处理后ATAC-seq可及性与RNA-seq表达变化的一致性
摘要
对酪氨酸激酶抑制剂（TKI，例如用于治疗EGFR突变肺腺癌的奥希替尼）的获得性耐药限制了长期疗效，并且常由非遗传机制引起。在此，我们定义了奥希替尼敏感和耐药的EGFR突变细胞模型及患者来源模型的染色质可及性和基因调控特征，并揭示了哺乳动物SWI/SNF染色质重塑复合物在TKI耐药中的作用。通过分析mSWI/SNF的全基因组定位，我们鉴定了耐药状态下的共同和癌细胞系特异性基因靶点。重要的是，对SMARCA4/SMARCA2 mSWI/SNF ATP酶的遗传学和药理学破坏，可通过抑制mSWI/SNF介导的、控制细胞增殖、上皮-间质转化、上皮细胞分化和NRF2信号传导的细胞程序调控，使一部分耐药细胞系和一个体内模型重新对奥希替尼敏感。这些数据突出了mSWI/SNF复合物在支持TKI耐药中的作用，并提示mSWI/SNF抑制剂在TKI耐药肺癌中的潜在用途。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- EGFR突变肺癌对奥希替尼的获得性耐药中，非遗传（表观遗传）机制如何发挥作用，mSWI/SNF染色质重塑复合物是否参与其中。
- 核心机制
- mSWI/SNF复合物在耐药状态发生全基因组重定位，通过SMARCA4/SMARCA2 ATP酶活性维持耐药相关基因程序，包括增殖、EMT、上皮分化和NRF2抗氧化信号，从而支持细胞在奥希替尼诱导的氧化应激下存活。
- 主要证据
- 多对EGFR突变肺癌亲本/奥希替尼耐药细胞系的RNA-seq、ATAC-seq和CUT&RUN显示染色质可及性与mSWI/SNF占位改变和耐药基因表达一致；SMARCA4敲低或Cmp14/FHD-286处理使部分耐药细胞系和YU-005C异种移植瘤重新对奥希替尼敏感，并伴随NRF2靶基因下调和ROS升高。
- 研究意义
- 提示mSWI/SNF复合物在支持TKI耐药中的作用，并提出mSWI/SNF抑制剂在TKI耐药肺癌中可能具有潜在应用价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
解析耐药状态的染色质可及性和基因表达特征
确定耐药细胞是否具有独特的染色质可及性改变及其与耐药基因表达程序的关系。
对四对细胞系进行ATAC-seq，并与RNA-seq整合，分析差异可及区域与差异表达基因的一致性。
鉴定mSWI/SNF复合物为耐药相关染色质调控因子
预测并验证调控耐药相关染色质可及性改变的染色质相关因子。
对RNA-seq差异基因进行Ingenuity Pathway Analysis，并用CUT&RUN分析SMARCA4、SMARCC1和H3K27ac在全基因组的占位，与ATAC-seq和RNA-seq整合。
遗传学抑制SMARCA4验证功能依赖性
检验SMARCA4对耐药细胞在奥希替尼存在下增殖和存活的必要性。
在PC9/PC9-OR、H1975/H1975-OR、HCC827/HCC827-OR及YU-005C中进行shRNA或CRISPR/Cas9介导的SMARCA4敲低/敲除，结合奥希替尼处理进行克隆形成、增殖和剂量反应检测。
体内验证SMARCA4敲除联合奥希替尼的疗效
在患者来源异种移植瘤模型中验证SMARCA4依赖性和奥希替尼再敏感化。
将YU-005C细胞皮下注射至NSG小鼠，待肿瘤建立后诱导SMARCA4敲除并给予奥希替尼，监测肿瘤体积。
药理学抑制mSWI/SNF ATP酶并评估与TKI的协同作用
检验mSWI/SNF ATP酶抑制剂能否使耐药细胞重新对奥希替尼敏感。
使用Cmp14和FHD-286联合奥希替尼或奥希替尼+曲美替尼，通过Combenefit计算Bliss协同评分，并进行Caspase-3/7活性和RNA-seq/ATAC-seq分析。
验证mSWI/SNF抑制对耐药基因程序和NRF2/ROS通路的影响
确定mSWI/SNF抑制逆转耐药转录程序及NRF2介导的氧化应激保护的机制。
对SMARCA4敲低或Cmp14联合处理后的细胞进行RNA-seq、ATAC-seq、motif分析、CellROX检测ROS、NRF2敲低及组织芯片IHC。
体内评估FHD-286联合奥希替尼对PDX肿瘤生长的影响
在体内验证药理学抑制mSWI/SNF ATP酶与奥希替尼联合的疗效。
在YU-005C皮下移植瘤小鼠中给予vehicle、奥希替尼、FHD-286或联合治疗18天，监测肿瘤体积。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证氧化应激
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher | A1049101 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | 16140–071 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher | 15140122 | |
| 细胞传代 | 0.25%胰酶-EDTA | Thermo Fisher | 25200056 |
| 药物处理 | 奥希替尼 | Selleckchem | S7297 |
| 曲美替尼 | Selleckchem | S2673 | |
| 奥希替尼 | MedChemExpress | HY-15772A | |
| 化合物14 | Jun Qi’s Laboratory | -- | |
| FHD-286 | Jun Qi’s Laboratory | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Blue细胞活力检测试剂盒 | Promega | G8081 |
| CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7573 | |
| 凋亡检测 | CellEvent Caspase-3/7 Green即用型试剂 | Invitrogen | R37111 |
| ROS检测 | CellROX绿色试剂 | Thermo Fisher | C10444 |
| CellROX深红色试剂 | Thermo Fisher | C10422 | |
| 免疫荧光 | Hoechst染料 | Thermo Fisher | 62249 |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher | P10144 | |
| 免疫荧光/免疫组化 | Triton X-100 | Sigma Aldrich | X-100 |
| 免疫组化 | 柠檬酸基抗原修复液 | Vector Laboratories | H-3300–250 |
| Tris基抗原修复液 | Vector Laboratories | H-3301–250 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP兔IgG过氧化物酶试剂盒 | Vector Laboratories | PK-4001 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP小鼠IgM过氧化物酶试剂盒 | Vector Laboratories | PK-4010 | |
| Vector NovaRED过氧化物酶底物试剂盒 | Vector Laboratories | SK-4800 | |
| Western blot | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher | 78440 |
| SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | Thermo Fisher | 34579 | |
| SuperSignal West Femto最高灵敏度底物 | Thermo Fisher | 34096 | |
| DNA提取 | DNeasy血液与组织DNA提取试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| 逆转录 | SuperScript III逆转录酶 | Thermo Fisher | 18080093 |
| RNA提取 | RNeasy RNA提取试剂盒 | Thermo Fisher | 74004 |
| 支原体检测 | MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | LT07–118 |
| 细胞鉴定 | GenePrint 10系统 | Promega | B9510 |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher | 13778150 |
| 慢病毒包装转染 | TransIT-293转染试剂 | Mirus | MIR2704 |
| CUT&RUN | CUTANA ChIC/CUT&RUN试剂盒 | Epicypher | 141048 |
| CUTANA CUT&RUN文库构建试剂盒 | Epicypher | 141001 | |
| BioMag Plus刀豆蛋白A磁珠 | PolySciences | 8605 | |
| 亚精胺 | Sigma-Aldrich | S2626 | |
| ATAC-seq | Tagment DNA酶和缓冲液大包装试剂盒 | Illumina | 20034197 |
| MinElute PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28006 | |
| 测序 | NextSeq 500/550 High Output试剂盒v2.5（75循环） | Illumina | 20024906 |
| RNA-seq | NEBNext Ultra II定向RNA文库构建试剂盒（Illumina） | New England Biolabs | E7760L |
| qPCR | Power SYBR Green预混液 | Thermo Fisher | 4367659 |
| 动物实验 | 基质胶 | Corning | 356237 |
| 多西环素饲料 | Envigo | TD.00426 | |
| 人肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130–095-92 | |
| 质粒 | pMD2.G质粒 | Addgene | Addgene_12259 |
| psPAX2质粒 | Addgene | Addgene_12260 | |
| shRNA表达 | pInducer10-mir-RUP-PheS载体 | Addgene | Addgene_44011 |
| sgRNA表达 | TLCV2载体 | Addgene | Addgene_87360 |
| shRNA表达 | pLKO.1 puro载体 | Addgene | Addgene_8453 |
| NRF2敲低 | NRF2 shRNA 1 | Sigma-Aldrich | TRCN0000007556 |
| NRF2 shRNA 2 | Sigma-Aldrich | TRCN0000007557 | |
| NRF2 shRNA 3 | Sigma-Aldrich | TRCN0000007558 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 耐药细胞系建立 | 奥希替尼起始浓度25 nM，逐步增加25/50/100 nM；最终维持浓度PC9-OR 1 μM、HCC827-OR 1 μM、H1975-OR 2 μM；PC9-OR*和HCC4006-OR为100 nM处理至少2个月 阅读提示：STAR Methods中Cell Lines小节 |
| SMARCA4敲低/敲除与奥希替尼处理 | shRNA诱导7天后处理；多西环素浓度1 μg/mL（PC9-OR shRNA、YU-005C sgRNA）或2 μg/mL（YU-005C shRNA）；奥希替尼剂量PC9-OR/HCC827-OR 750 nM、H1975-OR 1500 nM 阅读提示：STAR Methods中siRNA Design and Expression Vectors及Drug Treatments for Genomics小节，Figure 3图注 |
| YU-005C体内SMARCA4敲除联合奥希替尼 | 每只小鼠5×10^6细胞，matrigel 1:3；奥希替尼25 mg/kg每日口服灌胃；多西环素饮食7天后开始治疗，治疗2周；每组6只，两个独立重复 阅读提示：STAR Methods中Animal Models小节，Figure 3H–I图注 |
| Cmp14/FHD-286联合奥希替尼的协同实验 | PC9*和PC9-OR*使用奥希替尼100 nM+曲美替尼30 nM±Cmp14 1 μM；HCC827GR6单用奥希替尼；FHD-286联合剂量反应使用100 nM；Combenefit 6×6矩阵处理72小时 阅读提示：STAR Methods中Cell Growth, Viability & Drug Synergy Assays及Drug Treatments for Genomics小节，Figure 5A、Figure 7A–B图注 |
| YU-005C体内FHD-286联合奥希替尼 | 每只小鼠5×10^6细胞，matrigel 1:3；肿瘤约50 mm³开始治疗；奥希替尼25 mg/kg、FHD-286 1.5 mg/kg每日口服灌胃；每组7只，治疗18天 阅读提示：STAR Methods中Animal Models小节，Figure 7D–E图注 |
| RNA-seq/ATAC-seq/CUT&RUN样本处理 | PC9-OR*实验前洗脱奥希替尼7天；药物处理24小时后收集；ATAC-seq每条件100,000个细胞，生物学重复2个（YU-005C为3个）；CUT&RUN 12个循环扩增 阅读提示：STAR Methods中Drug Treatments for Genomics、ATAC-seq和CUT&RUN小节 |