建立dMLH1肿瘤模型
探究MLH1缺陷对肿瘤生长和免疫原性的影响
使用CRISPR-Cas9在4T1和B16-OVA细胞中敲除Mlh1，筛选克隆并体外传代，然后接种到免疫 competent小鼠中观察肿瘤生长。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
错配修复缺陷肿瘤细胞中的DNA感知对抗肿瘤免疫至关重要
DNA Sensing in Mismatch Repair-Deficient Tumor Cells Is Essential for Anti-tumor Immunity.
实验完整度
高包含体外细胞模型、多种基因敲除小鼠模型、人源化小鼠模型和临床样本分析，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠乳腺癌细胞系4T1及其Mlh1敲除变体 小鼠黑色素瘤细胞系B16-OVA及其Mlh1敲除变体 小鼠结肠癌细胞系MC38-OVA及其Mlh1敲除变体 人结肠癌细胞系HCT116及其MLH1敲除/回补变体
重点核对
肿瘤细胞中Mlh1敲除的克隆筛选及MLH1蛋白缺失的Western blot确认 dMLH1肿瘤细胞中胞质DNA的定量（PicoGreen染色和qPCR） dMLH1肿瘤细胞中IFN-β的ELISA检测 STING或cGAS敲除对肿瘤生长和T细胞浸润的影响 ICB治疗中抗CTLA4和抗PDL1抗体的剂量和给药方案
摘要
在具有DNA错配修复缺陷（dMMR）的高突变癌症中，新抗原的增加被认为是抗PD-1治疗高客观缓解率的主要贡献因素。然而，耐药机制尚未完全了解。使用MMR基因Mlh1缺陷（dMLH1）的肿瘤模型，我们发现dMLH1肿瘤细胞以cGAS-STING依赖的方式积累胞质DNA并产生IFN-β，这使得dMLH1肿瘤进展缓慢且对检查点阻断高度敏感。在新抗原固定的模型中，dMLH1肿瘤有效诱导T细胞启动，并失去对检查点治疗的抵抗，独立于肿瘤突变负荷。相应地，肿瘤细胞中STING或cGAS的缺失减少了T细胞的肿瘤浸润，并赋予对检查点阻断的抵抗。在临床上，人dMMR癌症中cGAS/STING的下调与不良预后相关。我们得出结论，肿瘤细胞内的DNA感知对于dMMR触发的抗肿瘤免疫至关重要。本研究为抗dMMR癌症免疫治疗提供了新的机制和生物标志物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- dMMR肿瘤中除新抗原外，是否存在其他机制贡献于抗肿瘤免疫和对ICB的敏感性？
- 核心机制
- MLH1缺陷导致胞质DNA积累，激活肿瘤细胞内在的cGAS-STING通路，产生IFN-β，促进DC交叉提呈和CD8+ T细胞启动，从而增强抗肿瘤免疫和ICB疗效。
- 主要证据
- 在多种小鼠肿瘤模型和人细胞系中，dMLH1细胞积累胞质DNA并激活cGAS-STING-IFN通路；STING或cGAS敲除加速肿瘤生长并减少T细胞浸润；在新抗原固定的模型中，dMLH1肿瘤仍能增强T细胞启动和ICB疗效；临床样本中cGAS/STING高表达与更好的生存相关。
- 研究意义
- 揭示了dMMR肿瘤中DNA感知通路对抗肿瘤免疫的重要性，提供了cGAS/STING作为ICB治疗生物标志物的潜力，并为克服ICB耐药提供了新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证cGAS-STING通路在dMLH1肿瘤中的作用
确定肿瘤细胞内在的cGAS-STING通路对肿瘤生长和免疫的影响
在dMLH1细胞中敲除Sting或cGAS，接种到小鼠中，观察肿瘤生长和T细胞浸润；使用STING或cGAS缺陷小鼠进行对比。
检测dMLH1细胞中胞质DNA和IFN信号
探究MLH1缺陷是否导致胞质DNA积累和I型IFN信号激活
使用PicoGreen染色和qPCR检测胞质DNA，ELISA检测IFN-β，qPCR检测ISGs，Western blot检测STAT1磷酸化。
MLH1回补实验
验证MLH1缺失对胞质DNA和IFN信号的因果关系
在dMLH1细胞中回补MLH1，检测胞质DNA和IFN信号的变化，以及肿瘤生长。
新抗原固定模型中的T细胞启动实验
探究dMLH1介导的DNA感知是否独立于新抗原促进T细胞启动
使用OVA表达肿瘤细胞与BMDCs共培养，然后与OT-I T细胞共培养，检测T细胞增殖和细胞因子产生；体内使用OT-I T细胞转移和ELISPOT。
ICB治疗实验
评估DNA感知对ICB疗效的影响
在肿瘤模型中给予抗CTLA4和抗PDL1抗体，观察肿瘤反应和生存。
临床样本分析
探究cGAS/STING表达与dMMR癌症患者预后的关系
分析TCGA数据库和临床试验样本中cGAS/STING表达与生存的关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | Sigma-Aldrich | D6429 |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | -- | -- |
| 流式分选 | BD FACSAria II细胞分选仪 | BD | -- |
| Western blot | Amersham ECL Select试剂 | Amersham | -- |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 胞质DNA定量 | Pico488双链DNA定量试剂 | Lumiprobe life science solutions | 42010 |
| Prolong Diamond抗淬灭封片剂（含DAPI） | Thermo Fisher Scientific | 36962 | |
| Leica TCS SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| Tecan SPARK多功能微孔板读数仪 | Tecan | -- | |
| T细胞交叉启动 | 重组小鼠FLT3L | BioLegend | 576306 |
| CFSE细胞分裂追踪试剂盒 | BioLegend | 423801 | |
| EasySep小鼠CD11c阳性选择试剂盒II | STEMCELL | 18780 | |
| EasySep小鼠CD8+ T细胞分离试剂盒 | STEMCELL | 19853 | |
| 细胞因子检测 | BD CBA小鼠炎症试剂盒 | BD Biosciences | 552364 |
| 小鼠IFN-β ELISA试剂盒 | PBL Assay Science | 42410-2 | |
| ELISPOT | BD小鼠IFN-γ ELISPOT试剂盒 | BD Biosciences | 551083 |
| qPCR | SsoAdvanced通用SYBR Green预混液 | Bio-Rad | 1725272 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo-Invitrogen | 15596018 |
| 逆转录 | ProtoScript II逆转录酶 | NEB | M0368L |
| 流式细胞术 | APC抗小鼠CD8a抗体 | BioLegend | 100712 |
| PE抗小鼠CD3抗体 | BioLegend | 100206 | |
| 抗FcγIII/II受体抗体（克隆2.4G2） | BD Biosciences | 553141 | |
| 可固定活性染料eFluor 506 | -- | -- | |
| CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| Western blot | STING（D2P2F）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 13647S |
| cGAS（D3O8O）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 31659S | |
| 纯化小鼠抗人MLH-1抗体 | BD Biosciences | 550838 | |
| 磷酸化Stat1（Tyr701）（58D6）兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 9167 | |
| 微管蛋白抗体（B-5-1-2） | Santa Cruz Biotechnology | sc-23948 | |
| 体内实验 | 体内用抗小鼠CD8β抗体（Lyt 3.2） | BioXcell | BE0223 |
| 体内用抗小鼠PDL1抗体（10F.9G2） | BioXcell | BE0101 | |
| 体内用抗小鼠CTLA4抗体（9D9） | BioXcell | BP0164 | |
| 体内用抗小鼠IFNAR1抗体（MAR1-5A3） | BioXcell | BP0241 | |
| 阿替利珠单抗 | pharmacy | -- | |
| 伊匹木单抗 | pharmacy | -- | |
| T细胞刺激 | 卵清蛋白 | Sigma-Aldrich | A2512 |
| OVA257-264肽（SIINFEKL） | Invivogen | vac-sin | |
| SIY肽 | Sigma-Aldrich | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| dMLH1肿瘤模型建立 | Mlh1敲除的克隆筛选和验证、细胞传代天数、接种细胞数（1×10^6）、小鼠品系和年龄 阅读提示：Methods: Cell lines; Tumor growth and treatments; Figure 1A-B |
| STING或cGAS敲除实验 | 基因敲除的克隆验证、接种细胞数、小鼠品系、观察时间 阅读提示：Methods: Cell lines; Figure 1D-E; Figure S1C |
| ICB治疗实验 | 抗体剂量（抗CTLA4 200 µg/小鼠，抗PDL1 100 µg/小鼠）、给药途径（腹腔注射）、给药频率（每3天一次）、治疗持续时间、肿瘤植入方法（碎片移植或细胞注射） 阅读提示：Methods: Tumor growth and treatments; Figure 5; Figure S5 |
| T细胞启动实验 | BMDC与肿瘤细胞共培养比例、T细胞与BMDC比例（1:2和1:20）、CFSE标记浓度（2 µM）、共培养时间（2天）、OVA蛋白浓度（100 µg/ml） 阅读提示：Methods: In vitro cross-priming of T cells by BMDCs; Figure 4A-C |
| 胞质DNA定量 | 细胞数量（2×10^7）、胞质分离方法、Pico488稀释比例（1:200）、qPCR引物 阅读提示：Methods: Quantification of Cytosolic DNA; Figure 3C-D |