6-thio-dG对肿瘤细胞的体外活性及端粒损伤诱导
确认肿瘤细胞对6-thio-dG的敏感性及端粒相关DNA损伤。
用细胞活力 assay 和集落形成实验检测MC38、HCT116等细胞对6-thio-dG的敏感性；用TIF assay和免疫FISH检测端粒损伤和微核形成。
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端粒应激增强STING依赖的抗肿瘤免疫
Telomere Stress Potentiates STING-Dependent Anti-tumor Immunity.
实验完整度
高包含体外细胞系、同系小鼠肿瘤模型、基因敲除小鼠及人性化小鼠模型，并进行功能与机制验证。
主要模型
MC38小鼠结肠癌细胞系同系C57BL/6小鼠移植瘤模型 LLC和CT26小鼠肿瘤细胞系同系小鼠移植瘤模型 HCT116人结肠癌细胞系NSG-SGM3人性化小鼠移植瘤模型 A375人黑色素瘤细胞系NSG-SGM3小鼠移植瘤模型
重点核对
6-thio-dG剂量3 mg/kg腹腔注射，MC38和LLC模型于第7、8、9天给药，CT26模型于第5、6、7天给药 CD8+ T细胞清除使用200 μg抗CD8抗体（53-5.8），治疗开始前1天及之后每周两次，持续2-3周 宿主STING依赖性通过Tmem173−/−和Myd88−/−小鼠对比验证 肿瘤内源性STING/cGAS作用通过CRISPR/Cas9敲除Tmem173或Mb21d1的MC38细胞验证 PD-L1联合治疗中MC38模型于第10、11天给6-thio-dG，第13、17天给50 μg抗PD-L1抗体
摘要
端粒酶几乎在所有癌细胞中表达，因此是抗肿瘤治疗的一个有吸引力的靶点。在此，我们展示，使用端粒靶向药物6-硫代-2'-脱氧鸟苷（6-thio-dG）治疗，可在端粒酶表达的癌症的同系和人性化小鼠模型中，通过先天性和适应性免疫依赖的应答导致肿瘤消退。6-thio-dG治疗引起端粒相关的DNA损伤，该损伤被树突状细胞（DCs）感知，并激活宿主胞质DNA感知STING/IFN-I通路，从而增强DCs的交叉致敏能力和肿瘤特异性CD8+ T细胞活化。此外，6-thio-dG在晚期癌症模型中克服了对检查点阻断的耐药性。我们的结果揭示了端粒应激如何增加先天感知和适应性抗肿瘤免疫，并为将端粒靶向治疗与免疫治疗相结合提供了强有力的依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 6-thio-dG诱导端粒应激后，是否能启动先天性DNA感知并增强宿主抗肿瘤免疫应答？
- 核心机制
- 6-thio-dG在端粒酶阳性肿瘤细胞中诱导端粒相关DNA损伤，肿瘤DNA被树突状细胞摄取后激活宿主STING/IFN-I通路，增强DC交叉致敏能力并活化肿瘤特异性CD8+ T细胞。
- 主要证据
- 在MC38、LLC、CT26同系小鼠模型及HCT116人性化小鼠模型中，6-thio-dG治疗依赖CD8+ T细胞和宿主STING/IFN-I信号抑制肿瘤生长；体外共培养显示DC摄取肿瘤DNA并增加IFN-β产生和交叉致敏。
- 研究意义
- 揭示端粒应激可增加先天感知和适应性抗肿瘤免疫，为端粒靶向治疗与免疫检查点阻断联合应用提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
同系小鼠模型中6-thio-dG的抗肿瘤效果及免疫依赖性
验证6-thio-dG体内抗肿瘤效果是否依赖适应性免疫细胞，特别是CD8+ T细胞。
在MC38、LLC、CT26同系移植瘤模型中给予6-thio-dG，利用Rag1−/−小鼠和抗CD4/CD8抗体清除实验评估免疫细胞依赖性。
6-thio-dG增强肿瘤特异性T细胞应答和免疫记忆
检测6-thio-dG治疗后肿瘤浸润T细胞频率、抗原特异性T细胞活化及记忆应答。
流式细胞术检测TIL中CD3+、CD8+、Ki67+细胞和OVA特异性CD8+ T细胞；ELISPOT检测IFN-γ分泌；IFN-γ reporter小鼠检测体内YFP+ T细胞；肿瘤消退后再次接种MC38和LLC细胞评估记忆。
树突状细胞交叉致敏能力和IFN-I依赖性验证
验证6-thio-dG处理肿瘤细胞后是否增强DC交叉致敏能力，并检测宿主IFN-I信号的必要性。
BMDC与6-thio-dG预处理的MC38-OVA细胞共培养，再与OT-1 CD8+ T细胞共培养检测IFN-γ；ELISA检测IFN-β；Ifnar1−/−小鼠验证IFN-I信号依赖性。
宿主STING信号和肿瘤内源性STING/cGAS作用验证
确定6-thio-dG诱导的先天感知是否依赖宿主STING信号，并评估肿瘤内源性STING/cGAS的作用。
在Myd88−/−、Tmem173−/−小鼠中接种MC38肿瘤并给予6-thio-dG；用CRISPR/Cas9敲除MC38细胞的Tmem173或Mb21d1后接种小鼠；免疫印迹检测DC中TBK1磷酸化。
6-thio-dG与PD-L1阻断联合治疗晚期肿瘤
评估6-thio-dG是否克服晚期肿瘤对PD-L1阻断的耐药性。
在晚期MC38和LLC肿瘤模型中序贯给予6-thio-dG和抗PD-L1抗体，监测肿瘤生长、生存和肿瘤特异性IFN-γ应答；肿瘤消退后再挑战评估记忆。
人性化小鼠模型中6-thio-dG的抗肿瘤效果
在更接近临床的人性化免疫系统中验证6-thio-dG的抗肿瘤效果。
NSG-SGM3小鼠经CD34+造血干细胞重建人免疫系统后接种HCT116或A375肿瘤细胞，给予6-thio-dG并监测肿瘤生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 支原体检测 | 支原体污染检测试剂盒 | R&D | -- |
| 药物处理 | 6-硫代-2'-脱氧鸟苷 | Metkinen Oy | -- |
| 细胞活力检测 | CellTiter 96® Aqueous One Solution细胞增殖检测试剂 | Promega | -- |
| 集落形成实验 | 结晶紫 | Sigma | -- |
| TIF和微核检测 | γ-H2AX抗体 | Millipore | 05-636 |
| lamin A/C抗体 | Santa Cruz | 376248 | |
| Alexaflour 568标记的山羊抗小鼠抗体 | Invitrogen | -- | |
| 流式细胞术 | 可固定活性染料eFlour 506 | eBioscience | 65-0866-18 |
| True-Nuclear转录因子缓冲液套装 | BioLegend | 424401 | |
| CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter, Inc | -- | |
| ELISPOT | IFN-γ酶联免疫斑点检测试剂盒 | BD Bioscience | 551083 |
| CTL-ImmunoSpot® S6分析仪 | Cellular Technology Limited | -- | |
| BMDC培养 | 重组小鼠GM-CSF | BioLegend | 576306 |
| T细胞分离 | EasySep™小鼠CD8+ T细胞分离试剂盒 | STEMCELL | 19853 |
| DC分离 | EasySep™小鼠CD11c阳性选择试剂盒II | STEMCELL | 18780 |
| 胞质DNA提取 | Purelink基因组DNA试剂盒 | Invitrogen | K182002 |
| RT-qPCR | SsoAdvanced™通用SYBR® Green预混液 | Bio-Rad | 1725272 |
| 免疫印迹 | STING（D2P2F）兔单克隆抗体 | Cell Signaling | 50494 |
| 磷酸化STING（Ser365）（D8F4W）兔单克隆抗体 | Cell Signaling | 72971 | |
| TBK1/NAK抗体 | Cell Signaling | 3504 | |
| 磷酸化TBK1/NAK（Ser172）（D52C2）XP®兔单克隆抗体 | Cell Signaling | 5483 | |
| 亲环素A抗体 | Cell Signaling | 2175 | |
| HRP标记的抗兔IgG抗体 | Cell Signaling | 7074 | |
| Clarity Max Western ECL底物 | Biorad | 1705062 | |
| Supersignal West PicoPlus化学发光底物 | Thermoscientific | 34577 | |
| X射线胶片 | GeneMate | F-9024–8X10 | |
| 肿瘤消化 | I型胶原酶 | Sigma | C0130 |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| 人性化小鼠构建 | Ficoll® Paque Plus | GE healthcare | 45-001-750 |
| 抗人CD34微珠 | Stemcell | 17856 | |
| 抗体治疗 | InVivoMAb抗小鼠CD4抗体（GK1.5） | BioXcell | BE0003–1 |
| InVivoMAb抗小鼠CD8抗体（53–5.8） | BioXcell | BE0223 | |
| InVivoMAb抗小鼠NK1.1抗体（PK136） | BioXcell | BE0036 | |
| InVivoMAb抗小鼠CSF1R抗体（AFS98） | BioXcell | BE0213 | |
| 抗PD-L1抗体（阿替利珠单抗） | Genentech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 同系小鼠肿瘤模型中6-thio-dG给药 | 6-thio-dG剂量3 mg/kg，腹腔注射；MC38和LLC模型第7、8、9天给药，CT26模型第5、6、7天给药；肿瘤接种细胞数5×10^5（MC38、CT26）或1×10^6（LLC）；每组n=5 阅读提示：Methods中“Tumor growth and treatment”小节及Figure 1、5图注 |
| 免疫细胞清除实验 | 抗CD8、抗CD4、抗NK1.1或抗CSF1R抗体剂量200 μg，腹腔注射，治疗开始前1天及之后每周两次，持续2-3周 阅读提示：Methods中“Tumor growth and treatment”小节及Figure 1、3图注 |
| 宿主STING/IFN-I信号依赖性验证 | 使用Tmem173−/−、Myd88−/−和Ifnar1−/−小鼠，每组n=5，6-thio-dG 3 mg/kg第7、8、9天给药 阅读提示：Methods中“Tumor growth and treatment”小节及Figure 3F、4A-B图注 |
| 肿瘤内源性STING/cGAS敲除验证 | CRISPR/Cas9敲除MC38细胞Tmem173或Mb21d1，接种5×10^5细胞，6-thio-dG 3 mg/kg第7、8、9天给药 阅读提示：Methods中“Tmem173 and Mb21d1 KO MC38 cell line”及“Tumor growth and treatment”小节，Figure 4C-D图注 |
| 6-thio-dG与PD-L1阻断联合治疗 | MC38模型：6-thio-dG 3 mg/kg第10、11天，抗PD-L1 50 μg第13、17天；LLC模型：6-thio-dG 3 mg/kg第4、5、6、10、11天，抗PD-L1 200 μg第8、13天；均为腹腔注射 阅读提示：Methods中“Tumor growth and treatment”小节及Figure 5B、5E图注 |
| 体外DC交叉致敏实验 | MC38-OVA细胞预处理6-thio-dG浓度200 nM，4 h后洗去，继续培养72 h；BMDC与肿瘤细胞共培养过夜；BMDC与OT-1 T细胞共培养48 h 阅读提示：Methods中“In vitro co-culture of bone marrow dendritic cells (BMDC) and T cells”小节及Figure 3D-E图注 |
| 人性化小鼠模型构建及治疗 | NSG-SGM3雌鼠4周龄，100 cGy照射后静脉注射1×10^5人CD34+细胞；12周后确认人CD45+>50%；HCT116接种1×10^6细胞，6-thio-dG 3 mg/kg第8、9、10天给药 阅读提示：Methods中“Humanized mouse tumor models”小节及Figure 6D-E图注 |