虚拟筛选与FTO抑制剂鉴定
从化合物库中筛选潜在FTO抑制剂
基于FTO晶体结构对NCI DTP库（约260,000化合物）进行分层虚拟筛选（HTVS、SP、XP），选取top370，获得213个化合物，通过MTT和m6A去甲基化酶实验验证，鉴定CS1和CS2。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
靶向FTO抑制癌症干细胞维持和免疫逃逸
Targeting FTO Suppresses Cancer Stem Cell Maintenance and Immune Evasion.
实验完整度
高包含体外细胞系、原代细胞、小鼠模型、PDX模型、患者样本及多组学数据，并有功能与机制验证（敲除/过表达、突变体、体内成像等）。
主要模型
人AML细胞系（MONOMAC 6、NOMO-1、U937等） 原代AML患者CD34+细胞 小鼠AML模型（MA9、FLT3ITD/NPM1mut） PDX AML小鼠模型（2017–38、AML 3448、AML 2016–9）
重点核对
FTO抑制剂CS1和CS2的浓度（如CS1 100 nM、CS2 200 nM处理48 h；体内5 mg/kg/day隔日给药10次） FTO结合关键残基（CS1: H231/E234；CS2: K216/S229/H231）的突变验证 LILRB4表达变化（qPCR、Western blot、流式细胞术） 体内LIMITING DILUTION ASSAY的细胞剂量梯度（如1×10^6至1×10^2） RNA-seq的生物学重复数（至少3次独立重复）
摘要
FTO是一种RNA N6-甲基腺苷（m6A）去甲基化酶，在多种癌症中发挥致癌作用，为开发有效的靶向治疗提供了机会。在此，我们报道了两种有效的小分子FTO抑制剂，在多种类型的癌症中表现出强烈的抗肿瘤作用。我们发现，FTO的基因缺失和药理抑制通过抑制免疫检查点基因（尤其是LILRB4）的表达，显著减弱白血病干细胞/起始细胞的自我更新能力并重编程免疫反应。FTO抑制使白血病细胞对T细胞细胞毒性敏感，并克服低甲基化药物诱导的免疫逃逸。我们的研究表明，FTO在癌症干细胞自我更新和免疫逃逸中发挥关键作用，并突显了靶向FTO用于癌症治疗的广泛潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FTO抑制剂能否通过调控m6A修饰抑制癌症干细胞自我更新和免疫逃逸，从而发挥抗癌作用？
- 核心机制
- FTO通过m6A依赖性方式正向调控LILRB4表达（抑制YTHDF2介导的m6A修饰LILRB4 mRNA降解），从而促进免疫逃逸；FTO抑制可降低LILRB4等免疫检查点基因表达，增强T细胞毒性。
- 主要证据
- 体外和体内实验表明，CS1/CS2直接结合并抑制FTO活性，降低白血病干细胞频率，抑制LILRB4表达，使AML细胞对T细胞杀伤敏感；在PDX和小鼠模型中延长生存期。
- 研究意义
- 靶向FTO可抑制癌症干细胞自我更新和免疫逃逸，为癌症治疗（尤其是AML）提供了有潜力的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CS1/CS2与FTO直接结合的验证
确认CS1/CS2与FTO蛋白的直接相互作用及结合位点
通过NMR（CPMG、STD）、DARTS、CETSA以及突变体（FTOH231A/E234A、FTOK216A/S229A/H231A）结合实验验证直接结合。
FTO抑制对AML细胞活力和干细胞自我更新的影响
评估FTO抑制对AML细胞增殖、凋亡、分化及LSC/LIC自我更新的作用
通过MTT、流式细胞术（凋亡、细胞周期）、集落形成实验和体外/体内极限稀释实验（LDA）检测CS1/CS2或FTO KD对AML细胞及LSC/LIC频率的影响。
FTO/m6A轴调控LILRB4表达的机制研究
探究FTO是否通过m6A途径调控免疫检查点基因LILRB4表达
通过qPCR、Western blot、流式细胞术检测LILRB4表达；m6A dot blot和MeRIP-qPCR检测LILRB4 mRNA m6A修饰；mRNA稳定性实验（放线菌素D）分析FTO和YTHDF2对LILRB4 mRNA半衰期的影响。
FTO抑制增强T细胞杀伤和克服免疫逃逸
验证FTO抑制是否通过下调LILRB4使AML细胞对T细胞毒性敏感
体外共培养AML细胞（CS1/CS2预处理）与活化T细胞，流式检测GFP+ AML细胞存活；体内联合T细胞治疗或DAC治疗，监测生存期。
FTO抑制剂的体内抗白血病及抗实体瘤效果评估
评估CS1/CS2在动物模型中的治疗效力和毒性
在PDX AML模型、鼠AML模型、人乳腺癌皮下移植瘤模型中给予CS1（游离或胶束/β-环糊精包裹）或CS2，监测肿瘤负荷、生存期及毒性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gemini Bio-Products | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| Plasmocin预防剂 | InvivoGen | ant-mpp | |
| 细胞活力检测 | CellTiter 96非放射性细胞增殖检测试剂盒 | Promega | G4100 |
| 流式细胞术 | PE Annexin V凋亡检测试剂盒I | BD Biosciences | 559763 |
| 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| 派洛宁Y | Sigma-Aldrich | P9172 | |
| m6A检测 | m6A抗体 | Synaptic Systems | 202003 |
| Western blot | 抗FTO抗体 | Abcam | ab124892 |
| GAPDH抗体 | Santa Cruz | sc-47724 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700S | |
| LILRB4抗体 | Abcam | ab229747 | |
| 山羊抗兔IgG H&L（HRP） | Abcam | ab6721 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L（HRP） | Abcam | ab6789 | |
| 流式细胞术 | 抗人CD34 FITC抗体 | eBioscience | 11-0349-42 |
| 抗人LILRB4 PE抗体 | BioLegend | 333008 | |
| 抗人LILRB4 APC抗体 | eBioscience | 17-5139-42 | |
| 抗小鼠Lilrb4 Alexa Fluor 647抗体 | BioLegend | 144906 | |
| NMR | FTOΔN31蛋白 | -- | -- |
| DARTS | 链霉蛋白酶 | Roche | 10165921001 |
| m6A去甲基化酶实验 | m6A去甲基化酶检测试剂盒 | Abcam | ab233489 |
| 重组FTO蛋白 | Active Motif | 31572 | |
| 重组ALKBH5蛋白 | Active Motif | 31589 | |
| DNA去甲基化实验 | 重组TET1蛋白 | Active Motif | 31417 |
| RNA提取 | miRNeasy迷你试剂盒 | Qiagen | 217004 |
| cDNA合成 | QuantiTect逆转录试剂盒 | Qiagen | 205314 |
| qPCR | Maxima SYBR Green qPCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | K0253 |
| m6A免疫沉淀 | Magna MeRIP m6A试剂盒 | Millipore | 17-10499 |
| 生物发光成像 | D-荧光素 | Goldbio | LUCK |
| 动物实验 | β-环糊精 | Sigma-Aldrich | C0926 |
| 甲氧基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物 | Sigma-Aldrich | 900661 | |
| 地西他滨 | Sigma-Aldrich | A3656 | |
| 细胞培养 | 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P8833 |
| G418硫酸盐 | Thermo Fisher Scientific | 10131027 | |
| 杀稻瘟菌素 | Invivogen | ant-bl-1 | |
| 流式细胞术 | CD3磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-050-101 |
| CD34磁珠试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | |
| CD14磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-118-906 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| FTO抑制剂处理 | CS1和CS2的浓度、处理时间及溶剂（DMSO）浓度 阅读提示：Methods: Cell Viability and Proliferation Assay; Figure legends 2A-2D |
| 体内给药 | 给药剂量（5 mg/kg/day）、给药频率（隔日一次）、给药次数（10次）、给药途径（i.p.或i.v.）及制剂（游离、β-CD包裹或胶束包裹） 阅读提示：STAR Methods: Animal Procedures |
| 极限稀释实验 | 细胞接种密度梯度（体外：100、50、20、10、5、1细胞/孔；体内：1×10^6至1×10^2细胞/小鼠）及重复孔数（12孔/剂量） 阅读提示：STAR Methods: Limiting dilution assays |
| T细胞共培养 | AML细胞与T细胞的比例、共培养时间（12–16小时）及T细胞活化方式（CD3/CD28 Dynabeads和IL-2） 阅读提示：STAR Methods: Co-culture Assay with AML Cells and T cells |
| RNA-seq | 生物学重复数（3–4次）、测序平台（Illumina Hiseq 2500）及数据分析流程（STAR、RSEM、GSEA） 阅读提示：STAR Methods: RNA Sequencing and Data Analysis |