鉴定AURKB为MYC结合蛋白
寻找维持MYC稳定性和转录活性的结合蛋白
在Jurkat细胞中表达Flag-MYC，免疫沉淀后经质谱鉴定AURKB；通过共免疫沉淀验证相互作用，并定位结合区域至PEST结构域。
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Aurora B激酶直接磷酸化并稳定MYC促进T细胞白血病发生
Direct Phosphorylation and Stabilization of MYC by Aurora B Kinase Promote T-cell Leukemogenesis.
实验完整度
高包含体外激酶实验、细胞系、原代T-ALL细胞、斑马鱼模型、小鼠异种移植和PDX模型，以及功能验证和机制验证
主要模型
T-ALL细胞系（CUTLL1、HPB-ALL、KOPTK1、Jurkat等） 原代T-ALL细胞 斑马鱼T-ALL模型 NPG小鼠异种移植和PDX模型
重点核对
AZD1152浓度10 nM或50 nM处理时间24 h或时间梯度 MYC半衰期检测使用CHX 50 μg/mL 斑马鱼热休克处理37°C 45 min AZD1152体内剂量5 mg/kg，腹腔注射，每周三次或两次 长春新碱体内剂量0.2 mg/kg，每周两次或一次
摘要
MYC的失调在T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）中发挥重要作用，然而其失调机制尚不清楚。本文中，我们鉴定了一个负责Aurora B激酶（AURKB）与MYC相互激活的分子机制。AURKB直接磷酸化MYC的丝氨酸67位点，拮抗GSK3β介导的苏氨酸58磷酸化及随后的FBXW7介导的蛋白酶体降解。稳定的MYC与T细胞急性淋巴细胞白血病1（TAL1）协同直接激活AURKB转录，构成一个正向前馈环路，增强MYC调控的致癌程序。因此，AURKB抑制剂诱导显著的MYC降解，伴随强烈的白血病细胞死亡。这些发现揭示了AURKB-MYC调控环路是T细胞白血病发生的基础，并为通过AURKB抑制靶向致癌MYC提供了理论依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- T-ALL中MYC失调的机制是什么，以及如何靶向MYC？
- 核心机制
- AURKB直接磷酸化MYC S67，拮抗GSK3β介导的T58磷酸化和FBXW7介导的泛素化降解，稳定MYC；MYC与TAL1协同直接激活AURKB转录，形成正反馈环路。
- 主要证据
- 体外激酶实验证实AURKB磷酸化MYC S67；细胞实验显示AURKB抑制降低MYC半衰期并增加p-T58；斑马鱼模型显示AURKB协同Myc促进白血病发生且依赖S67；小鼠异种移植和PDX模型显示AZD1152与长春新碱协同抑制肿瘤生长并延长生存。
- 研究意义
- 揭示了AURKB-MYC调控环路在T细胞白血病发生中的作用，为通过AURKB抑制靶向致癌MYC提供了理论依据，并提示FBXW7突变状态可作为预测AZD1152敏感性的生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证AURKB调控MYC蛋白稳定性
探究AURKB对MYC蛋白水平的影响
敲低AURKB或使用AZD1152处理T-ALL细胞，检测MYC蛋白水平、半衰期及蛋白酶体抑制剂MG132的挽救效果。
验证AURKB磷酸化MYC S67并影响稳定性
确定AURKB直接磷酸化MYC的位点及其对MYC稳定性的影响
构建MYC S67A和S67D突变体，进行CHX追踪实验、体外激酶实验、免疫印迹检测p-S67，以及共免疫沉淀分析GSK3β结合。
验证MYC和TAL1激活AURKB转录
探究AURKB表达的调控机制
敲低MYC或TAL1检测AURKB表达，ChIP分析MYC和TAL1与AURKB启动子的结合，荧光素酶报告基因验证转录激活。
验证AURKB-MYC轴在体内促进白血病发生
评估AURKB及MYC S67磷酸化在斑马鱼T-ALL模型中的作用
在斑马鱼中共表达AURKB和Myc，或表达Myc S67D/S67A突变体，监测GFP荧光和 Myc蛋白半衰期。
评估AURKB抑制剂与长春新碱的协同抗白血病效果
测试AZD1152单用或与长春新碱联合在T-ALL细胞和小鼠模型中的疗效
在T-ALL细胞系中进行药物联合指数分析，在NPG小鼠异种移植和PDX模型中评估肿瘤负荷和生存期。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | Hyclone | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Hyclone | -- | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| β-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | -- | |
| DMEM培养基 | Hyclone | -- | |
| 支原体检测 | MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | -- |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 聚偏二氟乙烯膜 | Bio-Rad | -- | |
| SuperSignal化学发光底物 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫沉淀 | Protein G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ANTI-FLAG M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| 免疫印迹 | AURKA抗体 | Cell Signaling Technology | 14475 |
| AURKB抗体 | Cell Signaling Technology | 3094 | |
| AURKC抗体 | ABclonal | A7930 | |
| β-ACTIN抗体 | ABclonal | AC026 | |
| 免疫组织化学 | cleaved Caspase-3抗体 | ABclonal | A11021 |
| 免疫印迹 | FBXW7抗体 | Abcam | 109617 |
| FLAG标签抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| HA标签抗体 | ABclonal | AE008 | |
| HRP偶联HA标签抗体 | Roche | 12013819001 | |
| 组蛋白H3抗体 | Cell Signaling Technology | 3638 | |
| MYC (N-262)抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-764 | |
| MYC (9E10)抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | |
| MYC/N-MYC (D3N8F)抗体 | Cell Signaling Technology | 13987 | |
| Myc标签抗体 | ABclonal | AE010 | |
| NCL抗体 | ABclonal | A5904 | |
| NKX3.1抗体 | Sigma-Aldrich | SAB1412056 | |
| p53抗体 | Cell Signaling Technology | 9282 | |
| 免疫组织化学 | PCNA抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-56 |
| 免疫印迹 | 磷酸化Aurora A(Thr288)/Aurora B (Thr232)/Aurora C (Thr198)抗体 | Cell Signaling Technology | 2914 |
| 磷酸化组蛋白H3 Ser10抗体 | Millipore | 06-570 | |
| 磷酸化MYC S62抗体 | Cell Signaling Technology | 13748 | |
| 磷酸化MYC S67抗体 | PTM BioLabs | -- | |
| 磷酸化MYC T58抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-135647 | |
| 染色质免疫沉淀 | TAL1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-393287 X |
| 体外激酶实验 | 放射性ATP [γ-32P] | PerkinElmer | NEG502A |
| ATP | Thermo Fisher Scientific | 18330019 | |
| Aurora B激酶（GST标签，His标签） | BPS Bioscience | 40002 | |
| 药物处理 | Barasertib (AZD1152-HQPA) | Selleck | S1147 |
| 药物筛选 | FDA批准药物文库 | Selleck | L1300 |
| 蛋白酶体抑制 | MG132 | Selleck | S2619 |
| AURKB激活 | 诺考达唑 | Selleck | S2775 |
| 药物处理 | 长春新碱 | Selleck | S1241 |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | BioVision | K201 |
| 细胞毒性检测 | CellTox Green细胞毒性检测试剂盒 | Promega | G8743 |
| 染色质免疫沉淀 | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Sigma-Aldrich | 17-295 |
| 免疫组织化学 | DAB底物试剂盒 | Vector Laboratories | SK-4100 |
| 荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1980 |
| 体外激酶实验 | 体外蛋白激酶缓冲液 | Cell Signaling Technology | 9802S |
| RT-qPCR | iTaq Universal SYBR Green预混液 | Bio-Rad | 1725124 |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 |
| RT-qPCR | ReverTra Ace qPCR逆转录试剂盒 | TOYOBO | FSQ-101 |
| 细胞培养 | BL21 (DE3)感受态大肠杆菌 | Thermo Fisher Scientific | C601003 |
| DH5α感受态大肠杆菌 | Thermo Fisher Scientific | 12297016 | |
| 斑马鱼显微注射 | I-SceI大范围核酸酶 | NEB | -- |
| RNA测序 | TruSeq RNA文库构建试剂盒v2 | Illumina | -- |
| Illumina HiSeq X-Ten测序仪 | Illumina | -- | |
| Agilent Bioanalyzer 2100生物分析仪 | Agilent technologies | -- | |
| RNAClean XP试剂盒 | Beckman Coulter | -- | |
| 无RNase DNase套装 | QIAGEN | -- | |
| 流式细胞术 | Accuri C6流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| FACS Aria流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| AURKB调控MYC蛋白稳定性 | AZD1152处理浓度（10 nM）和时间（24 h） 阅读提示：Figure 2B和图注 |
| MYC半衰期检测 | CHX浓度（50 μg/mL）和处理时间点 阅读提示：STAR Methods中Time-course Analysis of MYC Degradation |
| AURKB磷酸化MYC S67 | 体外激酶实验条件：AURKB用量、GST-MYC用量、ATP浓度和反应时间 阅读提示：STAR Methods中In Vitro Protein Kinase Assay |
| 斑马鱼T-ALL模型 | 热休克处理条件（37°C 45 min）和注射DNA浓度（30 ng/μL） 阅读提示：STAR Methods中Zebrafish Studies |
| 体内药物处理 | AZD1152剂量（5 mg/kg）和给药频率，长春新碱剂量（0.2 mg/kg）和给药频率 阅读提示：STAR Methods中Cell Line-based Xenograft和Patient-derived Xenografts |