建立LIN28B过表达肝癌模型
验证LIN28B过表达是否足以在小鼠体内引发肝癌。
将ApoE-rtTA小鼠与TRE-LIN28B小鼠杂交，获得双转基因ApoE-LIN28B小鼠，通过饮水给予多西环素诱导肝细胞特异性过表达人LIN28B，观察肿瘤形成。
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Lin28b足以驱动小鼠模型中的肝癌并且是其维持所必需的
Lin28b is sufficient to drive liver cancer and necessary for its maintenance in murine models.
实验完整度
高使用多种转基因小鼠模型、条件性基因敲除、siRNA治疗、细胞系实验及PET/CT成像，包含功能验证和机制验证。
主要模型
ApoE-LIN28B转基因小鼠（肝细胞特异性过表达人LIN28B） LAP-MYC转基因小鼠（多西环素诱导MYC肝母细胞瘤模型） Alb-MYC转基因小鼠（肝细胞特异性诱导MYC肝母细胞瘤模型） H2.35细胞系（SV40永生化小鼠肝细胞）
重点核对
ApoE-LIN28B小鼠：多西环素1mg/mL或0.1mg/mL饮水给药，观察肿瘤发生 LAP-MYC模型：多西环素撤药诱导MYC表达，肿瘤在1月龄形成后随机分组治疗 siRNA治疗：p14腹腔注射、p24和p31静脉注射，每只20g小鼠每剂0.7mg/mL 条件性Lin28b敲除：他莫昔芬0.2mg/g体重腹腔注射连续3天，休息6天后再连续2天 DEN处理：2周龄单次25mg/kg腹腔注射，3周龄起多西环素1g/L
摘要
Lin28a/b是影响干细胞维持、代谢和肿瘤发生的RNA结合蛋白。低分化、侵袭性癌症常过表达Lin28，但其在肿瘤起始或维持中的作用尚未被明确界定。我们报道，LIN28B过表达足以在小鼠模型中引发肝母细胞瘤和肝细胞癌。我们还在MYC驱动的肝母细胞瘤中检测到Lin28b过表达，并且肝脏特异性敲除Lin28a/b减少了肿瘤负荷、延长了潜伏期并延长了生存期。针对Lin28b的静脉注射siRNA和条件性Lin28b敲除均减少了肿瘤负荷并延长了生存期。Igf2bp蛋白上调，并且在LIN28B过表达的背景下需要Igf2bp3来促进生长。因此，多种小鼠模型表明，Lin28b既足以引发肝癌，又是其维持所必需的。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Lin28b过表达是否足以引发肝癌，并且是否是肿瘤维持所必需的？
- 核心机制
- LIN28B通过抑制let-7以及部分通过上调Igf2bp1和Igf2bp3促进肝癌发生；肿瘤维持需要Lin28b，其缺失导致凋亡增加而非增殖减少。
- 主要证据
- ApoE-LIN28B转基因小鼠中LIN28B过表达足以诱发肝母细胞瘤和肝细胞癌；在MYC驱动的肝母细胞瘤中，Lin28a/b基因敲除或siRNA靶向Lin28b可减少肿瘤负荷并延长生存；H2.35细胞中Igf2bp3敲低在LIN28B过表达背景下显著抑制细胞增殖。
- 研究意义
- 表明Lin28b是肝癌发生和维持的关键 oncogene，靶向Lin28b可能成为过表达Lin28b的肝癌（如肝母细胞瘤和肝细胞癌）的潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析MYC驱动肝母细胞瘤中Lin28b表达
探究在MYC驱动的肝母细胞瘤中Lin28a/b是否异常激活。
使用LAP-MYC（四环素关闭系统）和Alb-MYC（四环素开启系统）两种MYC驱动肝母细胞瘤模型，通过qRT-PCR和免疫组化检测Lin28a/b表达及let-7水平。
遗传敲除Lin28a/b验证肿瘤维持作用
验证Lin28a/b缺失是否影响MYC驱动肝母细胞瘤的进展和生存。
在Alb-MYC背景下构建Lin28a/b双条件敲除小鼠（Lin28aFl/Fl或Fl/−; Lin28bFl/Fl或Fl/−; Alb-Cre），出生时诱导MYC，观察生存期、肿瘤负荷、凋亡和增殖。
siRNA和条件性敲除靶向Lin28b的治疗验证
验证靶向Lin28b是否可抑制已形成肿瘤的生长并延长生存。
在LAP-MYC小鼠肿瘤形成后，随机分组给予siLin28b 1、siLin28b 2或对照siRNA，或使用他莫昔芬诱导Ubiquitin-Cre/ERT2介导的Lin28b条件性敲除，监测生存、肿瘤负荷和凋亡。
Igf2bp3作为Lin28b下游效应分子的功能验证
探究Igf2bp家族是否介导Lin28b的促生长作用。
在H2.35细胞中过表达LIN28B，并用siRNA敲低Igf2bp3，检测细胞增殖；同时检测小鼠肿瘤和异种移植瘤中Igf2bp1/3表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 小鼠给药 | 多西环素 | -- | -- |
| 肿瘤诱导 | 二乙基亚硝胺 | -- | -- |
| 条件性基因敲除 | 他莫昔芬 | Sigma | -- |
| siRNA体内递送 | Invivofectamine转染试剂 | Invitrogen | 1377501 |
| FLOATALYZER透析装置 | Thermo Fisher Scientific | 08607021 | |
| siRNA体外转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Life Technologies | 11668019 |
| siRNA | 对照siRNA | Life Technologies | 4390843 |
| Igf2bp3 siRNA | Life Technologies | 4390771-s100444 | |
| Lin28b siRNA 1 | Life Technologies | 4390771-s117291 | |
| Lin28b siRNA 2 | Life Technologies | 4390771-s117292 | |
| 体内siRNA | 体内对照siRNA | Life Technologies | 4457289 |
| 体内Lin28b siRNA 1 | Life Technologies | 4457308-s117291 | |
| 体内Lin28b siRNA 2 | Life Technologies | 4457308-s117292 | |
| 免疫荧光 | 抗Lin28a抗体 | Cell Signaling | 8641 |
| 抗Lin28b抗体 | Cell Signaling | 5422 | |
| 抗Ki-67抗体 | Abcam | 15580 | |
| 抗磷酸化H3抗体 | Cell Signaling | 9706 | |
| 抗Cleaved Caspase-3抗体 | Cell Signaling | 9661 | |
| 抗c-MYC抗体 | Sigma | M4439 | |
| 抗Afp抗体 | R&D Systems | MAB1368 | |
| DAPI染料 | Vector Biolabs | NC9029229 | |
| Western blot | PVDF膜 | BioRad | 170-4159 |
| SuperSignal West Pico或Femto化学发光试剂 | Thermo Scientific | 34095 | |
| c-MYC抗体 | Santa Cruz | sc788 | |
| Igf2bp1抗体 | Cell signaling | 8482 | |
| IGF2BP3抗体 | Proteintech | 14642-1-AP | |
| β-Tubulin抗体 | Cell Signaling | 2128 | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| qRT-PCR | miScript II逆转录试剂盒 | Qiagen | 218161 |
| iScript逆转录预混液 | BioRad | 1708840 | |
| 免疫组化 | Cryo-gel包埋剂 | Tissue-Tek | 62806-01 |
| 亲和素/生物素封闭试剂盒 | Vector Laboratories | SP-2001 | |
| Elite ABC试剂盒和DAB底物 | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| PET/CT成像 | Siemens Inveon PET/CT多模态系统 | Siemens Medical Solutions | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LIN28B过表达肝癌模型建立 | 多西环素给药浓度（1mg/mL或0.1mg/mL）、给药途径（饮水）、小鼠基因型（ApoE-rtTA; TRE-LIN28B）、对照（TRE-LIN28B单转基因） 阅读提示：Methods: Mice段落；Figure 1B、S1N、S1O |
| MYC驱动肝母细胞瘤模型 | 多西环素诱导/撤药方案（LAP-MYC撤药，Alb-MYC出生时1mg/mL）、肿瘤形成时间（1月龄）、随机分组时间点 阅读提示：Methods: Mice段落；Results相应部分；Figure 3A、3B |
| siRNA治疗实验 | siRNA剂量（每只20g小鼠0.7mg/mL）、给药途径和时间（p14腹腔，p24和p31静脉）、siRNA序列（siLin28b 1和2）、对照（siScramble） 阅读提示：Methods: In vivo siRNA treatment段落；Figure 7A-7H |
| 条件性Lin28b敲除实验 | 他莫昔芬剂量（0.2mg/g体重）、给药方案（连续3天，休息6天，再连续2天）、基因型（Lin28bFl/Fl或Fl/−，对照至少一个WT等位基因）、敲除效率验证 阅读提示：Methods: Mice段落；Figure 7I、S4F、S4G |
| Igf2bp3功能验证 | 细胞系（H2.35）、siRNA浓度（25nM）、处理时间（3天）、LIN28B过表达方式（逆转录病毒）、增殖检测方法 阅读提示：Methods: Cell Lines, Constructs and Transfection Experiments段落；Figure 6G、6H |