RNAi合成致死筛选
鉴定其抑制可使CML细胞对伊马替尼杀伤敏感的基因。
将慢病毒shRNA文库转导K562细胞，嘌呤霉素筛选2周后，分为未处理组和伊马替尼1 μM处理72 hr组，继续培养1周，提取RNA，PCR扩增shRNA序列并生物素标记，与Affymetrix微阵列杂交分析shRNA丰度变化。
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Wnt/Ca2+/NFAT信号在Bcr-Abl抑制后维持Ph+白血病细胞存活
Wnt/Ca2+/NFAT signaling maintains survival of Ph+ leukemia cells upon inhibition of Bcr-Abl.
实验完整度
高包含RNAi合成致死筛选、多种细胞系功能验证、原代CML细胞及小鼠Ph+ ALL模型体内验证
主要模型
K562 CML细胞系 KBM7 CML细胞系 SUP-B15 Ph+ ALL细胞系 Ba/F3 Bcr-Abl及突变体细胞 ARF-/- p185 Bcr-Abl/GFP B-ALL小鼠模型
重点核对
K562细胞中FZD-8 shRNA（shB）敲低效率约50%，shA无显著敲低作为阴性对照 伊马替尼处理浓度与时间：0.1 μM或1 μM处理72 hr，部分实验48 hr CsA浓度1-5 μM与伊马替尼或达沙替尼联合处理48-72 hr KN93浓度0-10 μM与伊马替尼联合处理48 hr 小鼠模型：静脉接种5×10^5 ARF-/- p185 Bcr-Abl/GFP B-ALL细胞，3天后每日口服灌胃CsA 25 mg/kg和/或达沙替尼20 mg/kg
摘要
尽管Bcr-Abl激酶抑制剂在慢性髓性白血病（CML）治疗中已被证明有效，但它们通常无法完全清除Bcr-Abl+白血病细胞。为鉴定其抑制可使Bcr-Abl+白血病对Bcr-Abl抑制剂杀伤敏感的基因，我们在CML细胞中进行了基于RNAi的与伊马替尼合成致死筛选。该筛选鉴定出Wnt/Ca2+/NFAT信号通路的众多组分。拮抗该通路导致NFAT活性受损、细胞因子产生减少并增强对Bcr-Abl抑制的敏感性。此外，用环孢素A抑制NFAT促进了Bcr-Abl抑制剂达沙替尼对白血病细胞的清除，并显著提高了Bcr-Abl+急性淋巴细胞白血病（ALL）小鼠模型的生存率。将该通路靶向与Bcr-Abl抑制相结合可改善Bcr-Abl+白血病的治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 鉴定与Bcr-Abl抑制协同杀伤Ph+白血病细胞的基因或通路，以克服Bcr-Abl抑制剂不能完全清除白血病细胞的问题。
- 核心机制
- Wnt/Ca2+/NFAT信号通路通过钙调磷酸酶-NFAT轴维持NFAT依赖的细胞因子（如IL-4）自分泌产生，从而在Bcr-Abl抑制下提供代偿性生存信号。
- 主要证据
- RNAi合成致死筛选鉴定Wnt/Ca2+/NFAT组分；FZD-8敲低、CaMKII抑制剂KN93及钙调磷酸酶抑制剂CsA均降低NFAT报告活性并增强伊马替尼或达沙替尼对K562、KBM7、SUP-B15及原代CML细胞的杀伤；组成型活性NFATc1保护细胞；IL-4中和抗体增敏而外源IL-4逆转CsA效应；CsA联合达沙替尼在Ph+ ALL小鼠模型中完全清除白血病细胞并延长生存。
- 研究意义
- 提示将Wnt/Ca2+/NFAT通路抑制与Bcr-Abl抑制联合是治疗CML和Ph+ ALL的潜在治疗策略，并表明该RNAi筛选可作为发现其他癌症联合靶向治疗的模型。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
FZD-8敲低验证及NFAT活性检测
验证FZD-8敲低是否使CML细胞对伊马替尼敏感并影响NFAT活性。
用shA、shB或对照shRNA稳定转导K562细胞，qPCR检测FZD-8表达；伊马替尼处理后流式计数活细胞；NFAT-luciferase报告基因检测NFAT活性，并检测ionomycin刺激下的反应。
CaMKII和钙调磷酸酶抑制验证
验证抑制CaMKII或钙调磷酸酶是否增敏Bcr-Abl抑制剂并降低NFAT活性。
K562细胞分别用KN93或CsA与伊马替尼或达沙替尼联合处理，流式计数活细胞；NFAT-luciferase报告基因检测NFAT活性；Western blot检测Bcr-Abl底物磷酸化；在KBM7、SUP-B15、原代CML CD34+细胞及Ba/F3 Bcr-Abl突变体细胞中验证联合效应。
NFAT保护作用及细胞因子检测
验证NFAT激活是否保护CML细胞免受伊马替尼杀伤，并鉴定NFAT依赖的细胞因子。
K562细胞用PMA和/或ionomycin激活NFAT后伊马替尼处理，流式计数活细胞；转导组成型活性NFATc1-GFP逆转录病毒，伊马替尼和/或CsA处理后流式检测GFP+活细胞比例；细胞因子阵列检测CsA处理或FZD-8敲低后的条件培养基；IL-4中和抗体及外源IL-4处理Ba/F3 Bcr-Abl细胞。
体内联合治疗验证
验证CsA联合达沙替尼是否在体内增强清除Ph+白血病细胞。
C57BL/6小鼠静脉接种ARF-/- p185 Bcr-Abl/GFP B-ALL细胞，3天后分组每日口服灌胃vehicle、CsA、达沙替尼或联合，流式监测外周血GFP+ B细胞，记录生存。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNAi筛选 | 慢病毒人50K shRNA文库 | GeneNet, SBI | -- |
| Trizol试剂 | Invitrogen | -- | |
| M-MLV逆转录酶 | Epicentre | -- | |
| Affymetrix HG-U133+ 2.0微阵列 | Affymetrix | -- | |
| 细胞活力检测 | Quanta SC流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 集落形成实验 | MethoCult培养基 | Stem Cell Technologies Inc. | -- |
| Western blot | 抗NFATc1抗体(7A6) | Santa Cruz | 7A6 |
| 抗lamin C抗体(636) | Santa Cruz | 636 | |
| 抗β-catenin抗体(clone14) | BD Transduction Laboratories | clone14 | |
| 抗α-tubulin抗体(DM1A) | NeoMarkers | DM1A | |
| 抗磷酸酪氨酸抗体(4G10) | Millipore | 4G10 | |
| 抗c-Abl抗体(#2681) | Cell Signaling Technology | 2681 | |
| 抗CrkL抗体(#3181) | Cell Signaling Technology | 3181 | |
| 抗Stat5抗体(#9351) | Cell Signaling Technology | 9351 | |
| 抗eIF4E抗体(#9742) | Cell Signaling Technology | 9742 | |
| 报告基因检测 | 萤火虫荧光素酶检测 | Promega | -- |
| 细胞因子检测 | 人细胞因子阵列3.0 | Panomics | -- |
| 流式分析 | 抗小鼠B220-APC抗体 | eBioscience | -- |
| 抗小鼠B220-PE抗体 | eBioscience | -- | |
| 抗小鼠Mac1-PE-Cy7抗体 | eBioscience | -- | |
| 动物实验 | 环孢素A (Neoral) | Novartis | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| RNAi合成致死筛选 | shRNA文库感染复数、嘌呤霉素筛选浓度与时间、伊马替尼处理浓度与时间、微阵列杂交条件、shRNA丰度变化阈值 阅读提示：Experimental Procedures中shRNA screen and analysis小节及Supplemental Information |
| FZD-8敲低验证 | shRNA序列及敲低效率、伊马替尼处理浓度与时间、NFAT报告基因感染与检测条件、ionomycin浓度与处理时间 阅读提示：Figure 1 legend及Experimental Procedures中Cell culture、Reporter assays小节 |
| CaMKII和钙调磷酸酶抑制验证 | KN93和CsA浓度范围、联合用药处理时间、细胞系来源与培养条件、原代CML样本来源与集落形成实验条件 阅读提示：Figure 2、Figure 3、Figure 4 legend及Experimental Procedures中Cell culture、Cell viability assays、Colony forming assays小节 |
| NFAT保护作用及细胞因子检测 | 组成型活性NFATc1构建体来源、PMA和ionomycin浓度与处理时间、IL-4中和抗体浓度、条件培养基制备条件、细胞因子阵列型号 阅读提示：Figure 5、Figure 6 legend及Experimental Procedures中Reporter assays、Cytokine assays小节 |
| 体内联合治疗验证 | 小鼠品系与周龄、接种细胞数量与途径、CsA和达沙替尼剂量与给药方式、vehicle组成、分组样本量、流式监测时间点 阅读提示：Figure 7 legend及Experimental Procedures中Mice小节 |