SsDddA酶的制备与活性验证
确认重组SsDddA具有高催化活性、低序列偏好性并适用于染色质足迹标记。
在大肠杆菌中表达并纯化SsDddA与SsDddI复合物，经变性复性分离后，用质谱法定量dsDNA上胞苷脱氨比例，并对处理后的细胞核DNA进行长读长测序分析脱氨序列基序。
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利用DAF-seq绘制单细胞二倍体染色质纤维结构图谱
Mapping single-cell diploid chromatin fiber architectures using DAF-seq.
实验完整度
高包含体外酶学验证、多细胞系靶向测序、单细胞全基因组扩增测序、原代组织及多种组学交叉验证
主要模型
GM12878淋巴母细胞系 GM24385淋巴母细胞系 COLO829BL/COLO829T细胞混合物 冷冻原代人肝、结肠等组织
重点核对
SsDddA反应条件：4 μM酶浓度、25°C处理10分钟 GM12878细胞NAPA与WASF1启动子靶向扩增测序验证脱氨特异性 单细胞PTA全基因组扩增后PacBio HiFi测序，12个细胞测序深度12–133 Gb COLO829 BL:T 49:1混合物中CC>TT变异VAF检测（Illumina为1.4%，DAF-seq为1.5%） rs2280838单倍型对SLC39A4启动子染色质激活的影响（Fisher精确检验P=5.4×10−10）
摘要
基因调控由蛋白质沿单个细胞中染色体长度染色质纤维的共同结合所编排，然而在二倍体生物中，这种占据在单倍型之间和细胞之间的异质性仍难以解析。在此，我们提出脱氨酶辅助的单分子染色质纤维测序（DAF-seq），它能够以接近核苷酸的分辨率进行单分子足迹分析，同时同步分析单分子染色质状态和DNA序列。DAF-seq揭示了单个调控元件上的协同蛋白占据，并解析了体细胞变异和罕见染色质表观等位基因的功能影响。单细胞DAF-seq（scDAF-seq）生成跨越每个单个细胞可映射基因组99%的染色体长度蛋白共占据图谱。ScDAF-seq揭示了单个二倍体细胞内和细胞间广泛的染色质可塑性，细胞内单倍型之间染色质激活差异达61%，细胞间差异达63%。此外，我们发现调控元件倾向于沿同一纤维以距离依赖的方式协同激活，这与黏连蛋白介导的环相呼应。总体而言，DAF-seq能够以单核苷酸、单分子、单倍型和单细胞精度表征整个染色体上的蛋白占据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何在单细胞、单分子和单倍型水平上解析二倍体生物中染色质纤维上蛋白质占据的异质性及其与基因调控的关系。
- 核心机制
- SsDddA对可及DNA中胞苷脱氨形成可遗传的C->T/G->A标记作为分子标识，从而在扩增后追踪同一DNA模板，实现单分子蛋白占据与DNA序列的同步读取。
- 主要证据
- 通过质谱和长读长测序验证SsDddA活性与序列偏好性；靶向DAF-seq在NAPA启动子解析TF协同占据；scDAF-seq在12个GM24385细胞中重建单倍型定相基因组并量化染色质激活差异；在肝组织和细胞系中解析SLC39A4启动子表观等位基因及低VAF体细胞变异的功能影响。
- 研究意义
- DAF-seq可在单核苷酸、单分子、单倍型和单细胞精度下表征整个染色体的蛋白占据，为研究非编码基因组结构功能、体细胞变异功能影响及单细胞染色质表观基因组提供工具。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
靶向DAF-seq反应条件优化
确定适用于染色质足迹分析的最佳SsDddA浓度和处理时间。
对GM12878细胞核进行不同浓度和时间处理，靶向扩增NAPA和WASF1启动子并用PacBio Revio测序，比较脱氨率、序列偏好及与DNase-seq/ATAC-seq/Fiber-seq的一致性。
单分子TF占据与协同性解析
解析NAPA启动子内11个TF结合元件的单分子占据及共占据模式。
对靶向DAF-seq reads按11个TF元件的占据模式聚类，计算各元件占据率，并基于热力学模型计算TF-DNA与TF-TF相互作用的自由能变化。
单倍型定相与染色质表观等位基因解析
验证DAF-seq区分生殖系变异与脱氨事件并进行单倍型定相的能力，解析SLC39A4启动子不同单倍型的染色质状态。
利用C/G碱基对仅一条链被脱氨的特性区分变异与脱氨，对含rs56269549的UBA1区域进行单倍型定相，并对肝组织和淋巴母细胞系SLC39A4启动子reads进行Leiden聚类分析。
低VAF体细胞变异功能解析
评估DAF-seq在低变异等位基因频率下同时检测体细胞变异及其染色质功能影响的能力。
对COLO829BL与COLO829T按49:1混合的细胞群进行靶向DAF-seq，跨chr17:19,447,245–19,447,246的CC>TT变异区域扩增测序，比较变异与参考reads的CTCF占据和染色质可及性。
单细胞全基因组与染色质图谱构建
在单个二倍体细胞中重建染色体尺度单倍型定相基因组并量化染色质激活模式。
对通透化GM24385细胞进行SsDddA处理，FACS分选单细胞入96孔板，PTA全基因组扩增后用PacBio HiFi测序，基于脱氨模式将重叠reads合并为一致性reads并用父母本短读长数据定相。
单细胞染色质可塑性与共激活分析
量化细胞内单倍型间及细胞间染色质激活差异，并检验调控元件沿同一纤维的共激活是否呈距离依赖。
基于Fiber-seq定义的GM24385调控元件，比较同一细胞内两单倍型间及不同细胞同一单倍型间的Jaccard距离，计算调控元件共依赖评分并按基因组距离分箱，同时分析CTCF环锚点的单分子共占据。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | LB琼脂培养基 | RPI | L24030–100.0 |
| 卡那霉素 | Gold Biotechnology | K-120 | |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 | ThermoFisher | R0393 | |
| 克隆与蛋白表达 | DH5α感受态细胞 | NEB | C2987H |
| BL21(DE3)感受态细胞 | NEB | C2527H | |
| 蛋白纯化 | pColADuet-1载体 | LifescienceMarket | PVT0105 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific | PIA32955 | |
| HisTrap HP His标签蛋白纯化柱 | Cytiva | 17524801 | |
| NGC Quest 10 Plus色谱系统 | Bio-Rad | 7880003 | |
| 盐酸胍 | ThermoFisher | 24110 | |
| HiLoad Superdex 200 pg制备型尺寸排阻柱 | Cytiva | 28989335 | |
| 1 M Tris-HCl缓冲液 | ThermoScientific | J22638-K2 | |
| 质谱分析 | 稳定同位素标记2-脱氧胞苷三磷酸 | MilliporeSigma | 646229 |
| 稳定同位素标记2-脱氧腺苷三磷酸 | MilliporeSigma | 646237 | |
| 磷酸二酯酶I | Worthington | LS003926 | |
| Benzonase核酸酶 | MilliporeSigma | E1014 | |
| Quick CIP碱性磷酸酶 | NEB | M0525S | |
| Nanosep离心过滤器（3 kDa截留） | Pall | OD003C33 | |
| ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱 | Agilent | 959757–902 | |
| 全基因组扩增DAF-seq | 5% SDS | ThermoFisher | AM9820 |
| 高分子量DNA提取试剂盒 | Promega | A2920 | |
| REPLI-G Mini全基因组扩增试剂盒 | Qiagen | 150023 | |
| 细胞核分离 | Cellometer Spectrum细胞计数器 | Nexcelom | -- |
| ViaStain吖啶橙/碘化丙啶溶液 | Nexcelom | C52–0106-5 | |
| 1.5 mL离心管 | Eppendorf | 022363204 | |
| DNA提取 | Monarch基因组DNA纯化试剂盒 | New England Biolabs | T3010S |
| DNA定量 | Qubit 1X dsDNA高灵敏度定量试剂盒 | Invitrogen | Q33231 |
| PCR扩增 | LongAmp热启动Taq 2×预混液 | New England Biolabs | M0533L |
| PCR纯化 | Monarch PCR与DNA纯化试剂盒 | New England Biolabs | T1030L |
| CpG甲基化分析 | M.SssI CpG甲基转移酶 | New England Biolabs | M0226S |
| 文库制备与测序 | SMRTbell文库制备试剂盒3.0 | PacBio | 102–141-700 |
| SMRTbell条形码接头板3.0 | PacBio | 102–009-200 | |
| 单细胞分选 | BD FACSAriaII流式细胞分选仪 | BD | -- |
| 细胞缓冲液 | BioSkryb Genomics | 100183 | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Fisher | 11875093 |
| 胎牛血清 | Fisher | 10082147 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma Aldrich | D2650–100ML | |
| 细胞计数 | 台盼蓝 | Fisher | 15250061 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 靶向DAF-seq反应 | SsDddA浓度4 μM、25°C处理10分钟、细胞核数量、反应终止方式 阅读提示：Methods中DddA Reactions小节 |
| 单细胞DAF-seq | GM24385细胞通透化条件、FACS单细胞分选、PTA扩增参数、测序深度 阅读提示：Methods中Single-cell FACS与Single-cell PTA Whole Genome Amplification小节，Fig. 5a |
| 靶向扩增 | 引物序列、退火温度、延伸时间及top/bottom strand扩增偏好筛选 阅读提示：Methods中PCR Amplification of SsDddA-treated genomic DNA小节及Supplementary Table 8 |
| 单倍型定相 | rs56269549、rs2280838、rs2280839等定相变异位点及父母本短读长数据 阅读提示：Methods中UBA1 Transcription Start Site Co-actuation and Codependency、DAF-seq Clustering小节 |
| 低VAF变异检测 | COLO829BL:COLO829T 49:1混合比例、靶向区域大小、VAF计算方式 阅读提示：Methods中COLO829 cell mixture小节及Fig. 4a |
| 染色质可塑性分析 | Fiber-seq FIRE峰值定义、MSP>150 bp激活阈值、Jaccard距离计算、启动子近端/远端划分（250 bp） 阅读提示：Methods中Single-cell chromatin actuation小节 |