序列空间扩散模型构建与训练
建立可在序列空间同时生成蛋白质序列和结构的扩散模型。
将蛋白质序列表示为L×20的one-hot张量并加噪，基于RoseTTAFold进行微调，训练模型从加噪序列预测原始序列和结构。
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利用RoseTTAFold序列空间扩散进行多状态和功能性蛋白质设计
Multistate and functional protein design using RoseTTAFold sequence space diffusion.
实验完整度
高包含计算设计、体外表达纯化、SEC/CD验证、晶体结构及NMR结构测定、细胞溶血实验等多种独立证据层级。
主要模型
PG计算的蛋白质序列-结构模型 大肠杆菌表达的重组蛋白质 人红细胞溶血实验
重点核对
设计蛋白质的SEC溶解性和单体性 CD光谱及热熔曲线验证二级结构和热稳定性 质谱检测二硫键数量和切割产物 AF2预测结构与设计模型的RMSD和pLDDT 晶体结构或NMR结构验证设计精度
摘要
蛋白质去噪扩散概率模型可用于从头生成蛋白质骨架，但在指导生成具有序列特异性属性和功能特性的蛋白质方面能力有限。为克服这一限制，我们开发了ProteinGenerator（PG），一种基于RoseTTAFold的序列空间扩散模型，可同时生成蛋白质序列和结构。PG从加噪的序列表示出发，通过迭代去噪生成序列-结构对，并由所需的序列和结构蛋白质属性引导。我们设计了具有不同氨基酸组成和内部序列重复的热稳定性蛋白质，以及笼蔽生物活性肽（如蜂毒肽）的蛋白质。通过对具有不同结构约束的扩散轨迹之间的序列logits进行平均，我们设计了多状态父-子蛋白质三元组，其中同一序列在完整父状态下折叠成不同的超二级结构，而在分裂为两个子结构域时折叠成不同的结构。PG设计轨迹可由实验序列-活性数据引导，为蛋白质功能的计算与实验集成优化提供了通用方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否在序列空间进行扩散以同时生成蛋白质序列和结构，并利用序列和结构约束指导设计具有特定属性、多状态和功能活性的蛋白质？
- 核心机制
- PG基于RoseTTAFold在序列空间进行扩散，迭代去噪同时生成序列和结构，并通过序列偏置、结构条件、多约束logits平均和实验活性数据梯度引导设计。
- 主要证据
- 计算设计结合AF2评估，实验验证包括SEC、CD、质谱、晶体结构、NMR结构以及红细胞溶血实验，证明设计蛋白具有预期结构、稳定性和条件性膜裂解活性。
- 研究意义
- PG提供了一种通用方法，可整合计算与实验优化蛋白质功能，并适用于多状态设计、生物活性肽笼蔽和机器学习辅助的定向进化。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
无条件蛋白质生成与实验表征
验证PG生成可折叠、可溶且热稳定蛋白质的能力。
无条件生成70–80个氨基酸的蛋白质，经AF2过滤后实验测试溶解度、单体性、二级结构和热稳定性。
氨基酸组成偏置设计
验证PG能否设计富含特定氨基酸并保持折叠和稳定性的蛋白质。
在去噪过程中对目标氨基酸出现频率最高的位置施加偏置，生成富含色氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、组氨酸和甲硫氨酸的蛋白质并进行实验表征。
序列重复蛋白质设计
验证PG能否设计具有序列对称性的重复蛋白质。
在去噪过程中施加重复对称性，并结合二级结构条件生成全α、全β和混合α/β重复蛋白质，进行SEC、CD和晶体结构验证。
生物活性肽笼蔽设计
设计在外源蛋白酶作用下条件性释放生物活性肽的笼蔽蛋白质。
将蜂毒肽序列固定于N端，并设计furin切割位点于环区，通过二级结构条件化生成笼蔽蜂毒肽的蛋白质，实验验证切割和膜裂解活性。
多状态蛋白质设计
设计同一序列在完整和切割状态下折叠成不同结构的蛋白质。
对同一序列的父状态和两个子状态分别施加不同的二级结构条件，通过平均logits指导序列扩散，生成多状态蛋白质并进行CD和NMR验证。
实验数据引导的功能优化
验证PG能否利用实验活性数据指导序列生成以提高功能。
以GB1的IgG结合活性数据训练分类器，用分类器梯度引导PG扩散轨迹，进行三轮迭代设计并与贝叶斯优化比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
蛋白质表达与纯化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质粒构建 | NEBridge Golden Gate组装试剂盒 | New England Biolabs | -- |
| BL21感受态细胞 | New England Biolabs | -- | |
| 蛋白质纯化 | Ni-NTA琼脂糖树脂 | Qiagen | -- |
| Superdex S75 Increase 5/150 GL色谱柱 | Cytiva | 29148722 | |
| Superdex S75 Increase 10/300 GL色谱柱 | Cytiva | 29148721 | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL色谱柱 | Cytiva | -- | |
| CD光谱 | Jasco J-1500圆二色光谱仪 | Jasco | -- |
| 质谱 | Agilent G6230B飞行时间质谱仪 | Agilent | -- |
| AdvanceBio反相脱盐柱 | Agilent | -- | |
| 二硫键检测 | TCEP-HCl | Millipore Sigma | 646547-10X1ML |
| barcode提取 | 内切蛋白酶LysC | New England Biolabs | P8109S |
| 胰蛋白酶 | New England Biolabs | P8101S | |
| 磁性His pull-down磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 10103D | |
| NMR | 15N氯化铵 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-467 |
| 13C标记葡萄糖 | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-1396 | |
| Furin切割 | furin蛋白酶 | New England Biolabs | P8077S |
| 溶血实验 | 洗涤人红细胞 | Innovative Research | IWB3ALS40ML |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | |
| 蜂毒肽 | GenScript | RP20415 | |
| 96孔透明底微孔板 | Corning | 3598 | |
| Agilent BioTek Epoch 2 TSC酶标仪 | Agilent | -- | |
| 晶体学 | mosquito LCP结晶机器人 | SPT Labtech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 无条件蛋白质生成与实验表征 | 生成蛋白质长度70–80个氨基酸、生成步数25步、过滤条件AF2 pLDDT > 90且AF2 RMSD < 2 Å 阅读提示：Methods中Unconditional protein generation小节 |
| 氨基酸组成偏置设计 | 目标氨基酸组成20%、生成蛋白质长度70–80个氨基酸、生成步数25步、过滤条件AF2 pLDDT > 90、AF2 RMSD < 2 Å、SAP score < 30 阅读提示：Methods中Compositionally biased protein generation小节及Algorithm S3 |
| 多状态蛋白质设计 | 生成步数25步、DSSP条件字符串、父状态和子状态logits混合系数0.25 阅读提示：Methods中Multistate guidance小节及Algorithm S4 |
| 实验数据引导的功能优化 | GB1突变位点V39、D40、G41、V54，每轮生成96个设计，共3轮，分类器为两层MLP，引导尺度2.0（第二、三轮） 阅读提示：Methods中Iterative guidance小节及Fig. 1c,d |
| 生物活性肽笼蔽设计 | 蛋白质长度155个氨基酸、生成步数25步、蜂毒肽序列N端26个氨基酸、furin切割位点序列GRRKR、过滤条件AF2 pLDDT > 85、AF2 RMSD < 2 Å、SAP score < 40 阅读提示：Methods中Caging bioactive peptides小节 |