合成MAX来源的STRs
构建具有稳定二级和三级结构的模块化合成转录抑制因子
通过固相肽合成分别制备含S5氨基酸的碱性（B）和拉链（Z）螺旋，经闭环复分解装订，再通过马来酰亚胺-半胱氨酸连接形成约6 kDa的STRs。
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利用源自bHLH DNA结合结构域的模块化合成转录抑制因子靶向MYC
Targeting MYC with modular synthetic transcriptional repressors derived from bHLH DNA-binding domains.
实验完整度
高包含体外结合、细胞功能、蛋白质组学、晶体结构及多种细胞系验证，且具备机制与功能验证
主要模型
HeLa细胞 P493-6细胞 Ramos细胞 Jurkat细胞
重点核对
STR116和STR118的表观Kd值分别为3.5 nM和14 nM（EMSAs，n=3独立重复） STR116在20 μM处理24小时下降低MYC在E-box基因上的占用（ChIP-qPCR，n=2生物学重复） STR116在20 μM处理48小时下下调MYC依赖性蛋白表达（SILAC蛋白质组学，n=4独立生物学实验） STR116在0.625–40 μM范围内剂量依赖性抑制MYC依赖性细胞增殖（CTG试验，n=3生物学重复） B-Z与E-box DNA复合物晶体结构分辨率为2.7 Å（PDB ID: 7RCU）
摘要
尽管转录因子（TFs）在疾病中具有明确作用，但由于靶向蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用的挑战，它们作为药物靶点在很大程度上仍未被开发。在此，我们报道了一种化学策略，用于生成源自MAX的bHLH结构域的模块化合成转录抑制因子（STRs）。我们的合成方法产生了化学稳定的三级结构域模拟物，它们以纳摩尔亲和力协同结合MYC/MAX共识E-box基序，表现出与全长TFs相当或更强的特异性，并直接与MYC/MAX蛋白竞争DNA结合。先导STR直接抑制细胞中MYC的结合，在蛋白质组水平上下调MYC依赖性表达程序，并抑制MYC依赖性细胞增殖。STR:E-box DNA复合物的共结晶和结构测定证实，其以与全长bHLH TFs几乎相同的方式保留DNA识别。我们还进一步证明了源自其他bHLH-TFs的STRs的结构盲设计，证实STRs可用于开发靶向其他基因调控元件的TFs的高特异性模拟物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否基于bHLH DNA结合结构域设计模块化合成转录抑制因子，以直接靶向MYC/MAX的DNA结合并抑制MYC依赖性功能？
- 核心机制
- 源自MAX bHLH结构域的STRs通过形成‘交叉二聚体’ sandwich结构，协同结合E-box DNA，直接竞争性抑制MYC/MAX和MAX/MAX与DNA的结合，从而阻断MYC依赖性转录程序。
- 主要证据
- EMSAs显示STR116和STR118以纳摩尔亲和力结合E-box DNA并竞争MYC/MAX结合；ChIP-qPCR显示STR116降低MYC在E-box基因上的占用；SILAC蛋白质组学显示STR116下调MYC靶蛋白；细胞活力试验显示STR116抑制MYC依赖性增殖；晶体结构证实STR:E-box DNA复合物与MAX/MAX结构高度一致（RMSD 0.847 Å）。
- 研究意义
- 本研究建立了首个编码二级、三级和四级结构的稳定蛋白模拟物或肽类平台，为直接靶向TF DNA结合和下游表达程序提供了化学策略，并可重编程以创建针对其他bHLH TF家族成员的高特异性模拟物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估STRs的DNA结合亲和力与特异性
验证STRs是否高亲和力、高特异性结合E-box DNA并竞争MYC/MAX
使用EMSAs测定STRs与E-box或对照AP1寡核苷酸的结合，并进行竞争EMSA分析STRs与重组MAX/MAX或MYC/MAX蛋白的竞争能力。
评估STRs的结构稳定性与细胞渗透性
验证合成稳定化是否提高STRs的热稳定性、蛋白酶稳定性和细胞摄取
通过CD光谱分析二级结构，胰蛋白酶稳定性试验测定半衰期，条件培养基结合试验评估稳定性，并用FITC标记的STRs进行共聚焦显微镜和PAGE凝胶分析细胞摄取。
验证STRs对MYC依赖性表型的影响
确定STRs是否抑制MYC DNA结合并影响下游信号和细胞增殖
使用ChIP-qPCR检测MYC在E-box基因上的占用，SILAC蛋白质组学分析MYC靶蛋白表达，细胞活力试验评估对MYC依赖性细胞增殖的影响。
解析STR:E-box DNA晶体结构
直接确认STRs以类似全长bHLH TFs的方式识别E-box DNA
将B-Z与含5′-CACGTG-3′的17-mer寡核苷酸共结晶，通过X射线衍射和分子置换解析结构。
验证STR平台可重编程靶向其他bHLH TFs
确认STR设计策略可应用于其他bHLH TFs以产生特异性DNA结合模拟物
基于序列比对设计针对TFAP4和OLIG2的STRs（STR640和STR690），通过EMSA和qEMSA分析其序列特异性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白稳定性与结构
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| McCoy's 5A培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| STR合成 | Rink酰胺MBHA树脂 | MilliporeSigma | -- |
| HCTU缩合剂 | Chem-Impex | -- | |
| STR纯化与分析 | Xbridge Prep C18 5-μm OBN色谱柱 | Waters | -- |
| EMSAs | IRD700标记E-box探针 | Integrated DNA Technologies | -- |
| qEMSA | QIAEX II凝胶提取试剂盒 | Qiagen | 20021 |
| SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | 4309155 | |
| 蛋白表达与纯化 | 镍-次氮基三乙酸树脂 | EMD Millipore | 70666-4 |
| 无EDTA蛋白酶抑制剂片剂 | Roche | 4693132001 | |
| 蛋白-蛋白相互作用下拉 | Simply Blue SafeStain考马斯亮蓝染液 | Thermo Fisher Scientific | LC6060 |
| 体外胰蛋白酶稳定性试验 | 质谱级胰蛋白酶 | Thermo Fisher Scientific | 90057 |
| 蛋白质组学样品制备 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23255 |
| tC18 Sep-Pak固相萃取柱 | Waters | -- | |
| 高pH反相分级试剂盒 | Pierce | -- | |
| LC-MS/MS | Acclaim PepMap RSLC C18色谱柱 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞活力试验 | Pierce LDH细胞毒性检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88953 |
| CellTiter-Glo细胞活力检测试剂 | Promega | G9241 | |
| 荧光显微镜 | 含DAPI的原位封片剂 | Sigma-Aldrich | DUO82040 |
| Leica Stellaris 8激光扫描共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| Western blot | 兔抗c-Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 18583 |
| 鼠抗CCNB1抗体 | Cell Signaling Technology | 4135 | |
| 兔抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 兔抗LDHA抗体 | Cell Signaling Technology | 3582 | |
| IRDye 680LT山羊抗鼠二抗 | LI-COR | 926-68020 | |
| IRDye 800CW驴抗兔二抗 | LI-COR | 926-32213 | |
| 荧光素酶试验 | ONE-Step荧光素酶检测系统 | BPS | 60690 |
| ChIP-qPCR | c-Myc抗体（N-262） | SCBT | -- |
| 磁珠蛋白G | GeneScript | L00274 | |
| QIAQuick PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28104 | |
| Photo-ChIP-qPCR | Dynabeads MyOne链霉亲和素C1磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 65001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EMSAs | STR浓度范围、探针浓度（10 nM或0.5 nM）、结合缓冲液组成、孵育时间与温度、凝胶浓度与电泳条件 阅读提示：Methods中EMSAs小节 |
| 细胞活力试验 | 细胞接种数量（P493-6、Ramos、Jurkat约1,000细胞/孔）、STR116浓度范围（0.625–40 μM）、处理时间（72小时或48小时换液）、Tet浓度（0.1 μg/ml或0.005 μg/ml） 阅读提示：Methods中Cellular viability assays小节 |
| SILAC蛋白质组学 | SILAC标记 passages（至少5代）、STR116浓度（20 μM）和处理时间（48小时）、Tet浓度（0.1 μg/ml）和处理时间（72小时）、细胞数量（1.5百万或0.75百万/样品） 阅读提示：Methods中Proteomics sample preparation小节 |
| ChIP-qPCR | P493-6细胞处理顺序（Tet 0.1 μg/ml 24小时，洗涤，再STR116 20 μM 24小时）、抗体用量、qPCR引物序列 阅读提示：Methods中Competition ChIP–qPCR小节及Supplementary Table 2 |
| X射线晶体学 | B-Z浓度（200 μM）、寡核苷酸浓度（100 μM）、结晶条件（50 mM Tris pH 7.0、30% MPD、50 mM NaCl、10 mM MgCl2）、衍射数据收集与精修参数 阅读提示：Methods中X-ray crystallography and structural refinement小节及Supplementary Table 6 |