HepG2细胞培养与样品制备
获取可用于DIA分析的肽段样品
HepG2细胞在MEM+10% FCS中培养，用SDC缓冲液裂解，胰蛋白酶/Lys-C消化，SDB-RPS StageTips脱盐。
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MaxDIA实现基于文库和无文库的数据独立采集蛋白质组学分析
MaxDIA enables library-based and library-free data-independent acquisition proteomics.
实验完整度
高包含多种细胞系样本的DIA数据、多个基准数据集、FDR外部验证、定量准确性评估及多种仪器平台验证。
主要模型
HepG2细胞系 HeLa细胞系 HEK293细胞系 三物种蛋白质组混合物（人、酵母、大肠杆菌）
重点核对
MaxDIA与Spectronaut 13/14在HepG2技术重复数据上的鉴定数和定量CV比较 使用人/玉米混合文库的外部FDR验证 四物种基准数据集中MaxLFQ定量误差评估 SCIEX TripleTOF 6600和Bruker timsTOF Pro上的三物种基准定量准确性 BoxCar DIA和分级DIA的蛋白质鉴定深度与RNA-seq数据比较
摘要
MaxDIA是一个在MaxQuant软件环境中分析数据独立采集（DIA）蛋白质组学数据的软件平台。利用光谱文库，MaxDIA实现了深度蛋白质组覆盖，并且蛋白质定量的变异系数显著优于其他软件。MaxDIA在文库到DIA匹配和蛋白质水平上均配备了准确的错误发现率（FDR）估计，包括使用全蛋白质组预测光谱文库时。这是发现型DIA——对无文库的DIA样本进行无假设分析并具有可靠FDR控制——的基础。MaxDIA对碎片数据执行三维或四维特征检测，并且匹配的打分通过对鉴定特征进行机器学习而增强。MaxDIA的bootstrap DIA工作流执行多轮匹配，每轮重新校准的质量和匹配的严格性逐渐提高。将MaxDIA与两项新技术——BoxCar采集和俘获离子迁移谱——结合，均能实现深度且准确的蛋白质组定量。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MaxDIA能否在DIA蛋白质组学中实现基于文库和无文库的深度覆盖、精确定量及可靠的FDR控制？
- 核心机制
- MaxDIA通过bootstrap DIA多轮匹配逐步提高校准和过滤严格性，利用机器学习（XGBoost）增强匹配打分，并适配MaxLFQ进行混合定量。
- 主要证据
- 在HepG2技术重复中，MaxDIA鉴定蛋白质组数量与Spectronaut相当或更多，定量CV中位数为0.072，优于Spectronaut的0.109和0.114；外部FDR验证显示内部与外部FDR估计高度一致；四物种和三物种基准数据证实了准确的定量。
- 研究意义
- MaxDIA提供了一个完整的DIA软件基础设施，支持发现型DIA模式，并与BoxCar采集和离子迁移谱等新技术结合，实现深度准确的蛋白质组定量。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
高pH反相分级
生成用于DDA文库的肽段分级样品
150 µg蛋白质消化后，用Strata-X-C cartridge脱盐，ÄKTA系统上XBridge column分级，收集36个组分并合并为12个。
LC-MS/MS数据采集
获取DDA文库和DIA样本的质谱数据
肽段加载到40-cm反相柱，EASY-nLC 1200偶联Q Exactive HF-X，DIA方法基于Bruderer等。
MaxDIA数据分析
使用MaxDIA处理DIA数据，评估鉴定和定量性能
MaxQuant 2.0.0运行MaxDIA，默认参数，transfer q值0.3，与Spectronaut 13/14比较。
FDR准确性验证
评估MaxDIA的FDR估计可靠性
使用人/玉米混合文库，DIA样本仅含人，计算外部FDR并与内部FDR比较。
定量准确性评估
验证MaxLFQ在DIA中的定量精度
使用四物种基准数据集（人、线虫、酵母、大肠杆菌）和三物种基准数据集（SCIEX TripleTOF 6600和timsTOF Pro），计算 ratios 和CV。
BoxCar和分级DIA分析
评估BoxCar采集和分级DIA的鉴定深度
HEK293细胞裂解，肽段分级，BoxCar DIA采集，MaxDIA分析，与RNA-seq数据比较。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | MEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞裂解 | SDC缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白质消化 | 胰蛋白酶/Lys-C混合物 | Promega | V5071 |
| 蛋白质定量 | 660 nm蛋白定量试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 肽段脱盐 | SDB-RPS StageTips | 3M Empore | 2241 |
| 肽段分级 | Strata-X-C固相萃取柱 | Phenomenex | 8B-S029-TAK |
| XBridge色谱柱 | Waters | -- | |
| LC-MS/MS | EASY-nLC 1200液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q Exactive HF-X质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ReproSil-Pur C18-AQ树脂 | Dr. Maisch | -- | |
| timsTOF Pro分析 | timsTOF Pro质谱仪 | Bruker Daltonik | -- |
| nanoElute纳升液相色谱系统 | Bruker Daltonik | -- | |
| 反相C18色谱柱 | IonOpticks | -- | |
| BoxCar DIA | Aurora C18色谱柱 | IonOpticks | -- |
| Fusion Lumos质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| EASY-nLC 1200液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 样品制备 | Bioruptor Pico超声破碎仪 | Diagenode | -- |
| ThermoMixer混匀仪 | Eppendorf | -- | |
| NanoDrop微量分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HepG2细胞培养与样品制备 | 细胞系来源、培养基、裂解缓冲液组成、酶解比例、脱盐方法 阅读提示：Methods中'Cell culture and MS sample preparation'小节 |
| 高pH反相分级 | 起始蛋白量、分级柱规格、流速、缓冲液pH 阅读提示：Methods中'High-pH reversed-phase fractionation'小节 |
| LC-MS/MS数据采集 | 色谱柱规格、流速、MS1和DIA扫描参数、碰撞能量 阅读提示：Methods中'LC–MS/MS measurements'小节及Fig. 3图注 |
| MaxDIA数据分析 | 软件版本、FDR阈值、transfer q值、其他参数设置 阅读提示：Methods中'Data analysis'小节及Supplementary Notes |
| FDR准确性验证 | 文库组成（人+玉米）、DIA样本来源、FDR计算方式 阅读提示：Methods中'FDR curves'小节及Fig. 4图注 |
| 定量准确性评估 | 基准数据集来源、物种混合比例、MaxLFQ参数 阅读提示：Methods中'Data downloads'和'Data analysis'小节及Fig. 5图注 |
| BoxCar和分级DIA | 细胞系、分级方法、BoxCar扫描参数、文库构建方式 阅读提示：Methods中'BoxCar DIA HEK data'小节及Fig. 6图注 |