CTL蛋白质组图谱绘制
全面表征CTL蛋白质组的丰度和多样性
使用高分辨率质谱对P14 TCR转基因CTL进行无标记定量蛋白质组学分析，鉴定肽段和蛋白组，使用蛋白质组标尺方法估计绝对拷贝数。
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细胞毒性T细胞蛋白质组及其受激酶mTOR的塑造
The cytotoxic T cell proteome and its shaping by the kinase mTOR.
实验完整度
高包含定量蛋白质组学、转录组学、免疫印迹、代谢流分析、脂质测量等多层验证，并有功能验证。
主要模型
P14 TCR转基因小鼠来源的CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTL） P14 TCR转基因小鼠
重点核对
CTL培养：使用100 ng/mL gp33-41肽、20 ng/mL IL-2和2 ng/mL IL-12激活48小时，随后在IL-2/IL-12中培养96小时 抑制剂处理：rapamycin 20 nM、KU-0063794 1 μM、AKTi1/2 1 μM、IC-87114 10 μM，处理48小时（除非另有说明） 蛋白质组学：三个生物学重复，无标记定量，rapamycin处理48小时 代谢流分析：Seahorse XF24分析，使用oligomycin、DNP、antimycin A/rotenone PtdIns(3,4,5)P3测量：HPLC-MS，每样本1×10^6细胞
摘要
高分辨率质谱绘制了细胞毒性T淋巴细胞（CTL）蛋白质组以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）对CTL的影响。CTL蛋白质组以代谢调节因子和颗粒酶为主，mTORC1选择性抑制和促进约10%的CTL蛋白亚群的表达。这些蛋白包括关键的CTL效应分子、信号蛋白和一部分代谢酶。蛋白质组数据突显了mTORC1对CTL中磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸（PtdIns(3,4,5)P3）产生的潜在负调控。mTORC1被证明抑制PtdIns(3,4,5)P3产生，并决定mTORC2对激酶Akt激活的需求。因此，无偏蛋白质组分析提供了对CTL身份和mTORC1控制CTL功能的全面理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- mTORC1如何控制细胞毒性T淋巴细胞的蛋白质组和功能？
- 核心机制
- mTORC1选择性抑制和促进约10%的CTL蛋白表达，包括代谢酶、效应分子和信号蛋白；mTORC1抑制PTEN表达从而抑制PtdIns(3,4,5)P3产生，并决定mTORC2对Akt激活的需求。
- 主要证据
- 高分辨率质谱定量了6800多个蛋白，鉴定mTORC1调控的蛋白亚群；免疫印迹验证PTEN、IRS2等变化；HPLC-MS显示rapamycin增加PtdIns(3,4,5)P3；代谢流分析显示rapamycin降低糖酵解。
- 研究意义
- 无偏蛋白质组分析提供了对CTL身份和mTORC1控制CTL功能的全面理解，并揭示了mTOR抑制剂对T细胞信号转导的重编程作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
mTORC1调控的CTL蛋白质组分析
确定mTORC1抑制对CTL蛋白质组的影响
CTL用rapamycin（20 nM）处理48小时，进行定量质谱分析，比较对照和处理组的蛋白丰度变化，并通过免疫印迹和ELISA验证关键蛋白。
mTORC1对转录组和蛋白质组的比较
评估mTORC1抑制对转录物和蛋白质丰度的影响
使用Affymetrix微阵列分析rapamycin处理48小时的CTL转录组，与蛋白质组数据关联。
mTORC1对CTL代谢的调控分析
研究mTORC1抑制对糖酵解和谷氨酰胺分解的影响
测量rapamycin处理CTL的葡萄糖摄取、乳酸输出、耗氧率、细胞外酸化率和谷氨酰胺分解速率。
mTORC1对PtdIns(3,4,5)P3和Akt信号的影响
探究mTORC1抑制对PtdIns(3,4,5)P3水平和Akt磷酸化的影响
使用HPLC-MS测量PtdIns(3,4,5)P3水平，免疫印迹分析Akt T308和S473磷酸化，使用PI(3)K抑制剂和Akt抑制剂验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证转录组变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | gp33-41肽 | -- | -- |
| 白介素-2 | Proleukin | -- | |
| 白介素-12 | R&D systems | -- | |
| 抑制剂处理 | 雷帕霉素 | EMD Millipore | -- |
| Akt抑制剂1/2 | EMD Millipore | -- | |
| IC-87114 | synthesized in house | -- | |
| KU-0063794 | Tocris | -- | |
| 免疫印迹 | 4EBP1 p-S37/S46抗体 | Cell Signaling Technology | 2855 |
| 4EBP1 p-S65抗体 | Cell Signaling Technology | 9451 | |
| 4EBP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9452 | |
| S6K p-T389抗体 | Cell Signaling Technology | 9239 | |
| S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 9202 | |
| Akt p-T308抗体 | Cell Signaling Technology | 4056 | |
| Akt p-S473抗体 | Cell Signaling Technology | 4058 | |
| SMC1抗体 | Bethyl Laboratories | A300-055A | |
| T-bet抗体 | eBioscience | 14-5825 | |
| IRS2抗体 | Cell Signaling Technology | 4502 | |
| PTEN抗体 | Santa Cruz | sc-7974 | |
| Foxo1/3A p-T24/32抗体 | Cell Signaling Technology | 9464 | |
| FOXO1抗体 | Cell Signaling Technology | 9454 | |
| 葡萄糖摄取 | 2-脱氧-d-[1-3H]葡萄糖 | GE Healthcare | -- |
| ELISA | CD62L酶联免疫吸附测定试剂盒 | eBioscience | -- |
| IFN-γ酶联免疫吸附测定试剂盒 | eBioscience | -- | |
| Seahorse代谢流分析 | XF24细胞培养微孔板 | -- | -- |
| Cell-Tak细胞粘附剂 | -- | -- | |
| 谷氨酰胺分解实验 | [U-14C]-谷氨酰胺 | -- | -- |
| 脂质测量 | QTRAP 4000质谱仪 | AB Sciex | -- |
| C17:0/C16:0 PtdIns(3,4,5)P3内标 | -- | -- | |
| 蛋白质组学样品制备 | C18 Sep-Pak柱 | -- | -- |
| 培养细胞亚细胞分级分离试剂盒 | Pierce | -- | |
| 去污剂去除96孔离心板 | Pierce | -- | |
| 液相色谱-质谱联用 | Dionex RSLCnano高效液相色谱仪 | Dionex | -- |
| Velos Orbitrap质谱仪 | Thermo | -- | |
| 强阴离子交换色谱 | Dionex Ultimate 3000高效液相色谱系统 | Dionex | -- |
| AS24强阴离子交换柱 | Dionex | -- | |
| 尺寸排阻色谱 | mAbPacSEC柱 | Dionex | -- |
| 微阵列分析 | RNeasy RNA纯化迷你试剂盒 | QIAGEN | -- |
| 430_2.0小鼠表达阵列 | Affymetrix | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CTL培养与激活 | 小鼠品系（P14 TCR转基因）、性别和年龄（蛋白质组和微阵列实验：仅雌性，8-10周；其他实验：雌雄，7-18周）、激活肽浓度（100 ng/mL gp33-41）、IL-2浓度（20 ng/mL）和IL-12浓度（2 ng/mL）、培养时间（激活48小时，再培养96小时） 阅读提示：Online Methods的Cell culture小节 |
| 抑制剂处理 | rapamycin浓度（20 nM）、KU-0063794浓度（1 μM）、AKTi1/2浓度（1 μM）、IC-87114浓度（10 μM）、处理时间（通常48小时，IC-87114为1小时）、溶剂对照（DMSO） 阅读提示：Online Methods的Cell culture小节和图注（如Fig. 4a、Fig. 8b） |
| 定量蛋白质组学 | 细胞数量（25×10^6）、生物学重复数（三个）、rapamycin处理时间（48小时）、质谱平台（Velos Orbitrap）、数据分析软件（MaxQuant）和参数 阅读提示：Online Methods的Sample lysis and in-solution digest for mass spectrometry和Liquid chromatography mass spectrometry analysis小节 |
| 代谢流分析 | 细胞数量（150,000/孔）、Seahorse XF24设置、抑制剂（oligomycin、DNP、antimycin A/rotenone）添加顺序和时间点、生物学重复数（2或3） 阅读提示：Online Methods的Seahorse metabolic flux analyser小节和图注Fig. 7g,h |
| PtdIns(3,4,5)P3测量 | 细胞数量（1×10^6/样本）、内标量（1 ng C17:0/C16:0 PtdIns(3,4,5)P3）、HPLC-MS系统（QTRAP 4000）、rapamycin处理时间（48小时）、IC-87114处理时间（1小时） 阅读提示：Online Methods的Mass spectrometry measurements of inositol lipids小节和图注Fig. 8b |