构建Treg特异性PTEN敲除小鼠并评估自身免疫表型
确定PTEN在Treg细胞体内稳态和免疫耐受中的必要性
将Ptenfl/fl小鼠与Foxp3YFP-Cre小鼠杂交获得Ptenfl/flFoxp3-Cre小鼠，检测血清抗dsDNA和ANA抗体、Ig亚型、肾脏肾小球病理和IgG沉积，以及淋巴器官增生
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Treg细胞需要磷酸酶PTEN来抑制TH1和TFH细胞反应
Treg cells require the phosphatase PTEN to restrain TH1 and TFH cell responses.
实验完整度
高含Treg特异性基因敲除小鼠模型、骨髓嵌合体、谱系追踪、过继转移及转录组和代谢检测等多层证据与机制验证
主要模型
Ptenfl/flFoxp3-Cre小鼠（Treg特异性PTEN敲除） Ptenfl/flRictorfl/flFoxp3-Cre小鼠 Rag1−/−混合骨髓嵌合体 Ptenfl/+Foxp3-Cre杂合小鼠
重点核对
小鼠年龄：Ptenfl/flFoxp3-Cre小鼠除特别说明外使用10-12周龄，并以年龄和性别匹配的含Foxp3cre等位基因WT小鼠为对照 骨髓嵌合体构建：7×10^6 T细胞去除的骨髓细胞转移入亚致死剂量（5 Gy）照射的Rag1−/−小鼠，重建至少2.5个月 免疫方案：NP-OVA（100 μg）与LPS（10 μg）经明矾沉淀后腹腔注射；或静脉注射新鲜PBS洗涤的1×10^9 SRBC 流式检测线粒体：淋巴细胞与10 nM MitoTracker Deep Red或20 nM TMRM于37°C孵育30 min；ROS用5 μM MitoSOX Red检测 过继转移：将CD45.2+的CD4+CD25+Foxp3-YFP+细胞转移至CD45.1+受体，7天后分析Foxp3和CD25表达
摘要
效应T细胞与调节性T（Treg）细胞之间的相互作用对适应性免疫至关重要，但Treg如何控制多样的效应反应仍不清楚。我们发现磷酸酶PTEN将Treg稳定性与对TH1和TFH（滤泡辅助）反应的抑制联系起来。在Treg中敲除PTEN会导致过度的TFH和生发中心反应以及自发性炎症性疾病。这些缺陷可通过敲除干扰素-γ而得到相当程度的阻断，表明TH1和TFH反应受到协调控制。在机制上，PTEN维持Treg稳定性和糖酵解与线粒体适应性之间的代谢平衡。此外，PTEN缺失上调mTORC2-Akt活性，而丧失该活性可恢复PTEN缺陷Treg的功能。我们的研究建立了一个PTEN-mTORC2轴，该轴维持Treg稳定性并协调Treg介导的效应反应控制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Treg细胞中的磷酸酶PTEN在维持Treg稳定性及控制TH1和TFH效应反应中发挥何种体内功能与分子机制。
- 核心机制
- PTEN通过抑制mTORC2-Akt活性维持Treg稳定性和糖酵解与线粒体适应性之间的代谢平衡，从而协调抑制TH1和TFH反应；PTEN缺失导致mTORC2活性上调，删除Rictor可恢复PTEN缺陷Treg功能。
- 主要证据
- Treg特异性PTEN敲除小鼠出现狼疮样自身免疫病、TFH和GC B细胞及生发中心反应增强、IFN-γ产生增多；删除IFN-γ可显著阻断TFH、GC和自身抗体反应；谱系追踪和过继转移显示PTEN缺陷Treg丢失Foxp3；微阵列和代谢检测显示细胞周期、TFH相关基因及糖酵解/线粒体适应性改变；Ptenfl/flRictorfl/flFoxp3-Cre小鼠中上述异常被恢复。
- 研究意义
- 研究确立PTEN-mTORC2轴是维持Treg稳定性并协调Treg介导的TH1和TFH反应控制的核心通路，提示该信号轴可作为系统性自身免疫和淋巴增殖性疾病治疗干预的新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析免疫稳态及TFH/GC反应
明确PTEN缺失后T细胞活化状态及TFH和生发中心反应是否异常
流式检测CD4+、CD8+、B细胞、DC和中性粒细胞数量，CD62L/CD44表型，IFN-γ、CXCR3、IL-17和IL-4产生；检测Treg比例和数量、caspase-3和BrdU；检测CXCR5+PD-1+TFH、TFR、GL7+CD95+GC B细胞及PNA+生发中心；并用SRBC和NP-OVA免疫
骨髓嵌合体和IFN-γ敲除验证TH1与TFH协调控制
判断TFH反应增强是否为Treg细胞自主缺陷，以及IFN-γ在其中的作用
构建Ptenfl/flFoxp3-Cre:CD45.1+与WT:CD45.1+混合骨髓嵌合体，分析TFH、GC B和IFN-γ；将Ptenfl/flFoxp3-Cre与Ifng−/−杂交，检测TFH、GC B、生发中心、ANA和肾脏IgG沉积
谱系追踪和过继转移评估Treg稳定性
验证PTEN缺失是否导致Foxp3表达丢失和Treg功能不稳定
将Ptenfl/flFoxp3-Cre与Rosa26GFP报告小鼠杂交进行谱系追踪，检测GFP+YFP-Foxp3−细胞；流式检测Treg活化标志、ICOS、PD-1、GITR、CTLA4、CD25、Blimp1、IFN-γ、CXCR3、T-bet、Bcl6等；分选Foxp3+CD25+细胞过继转移至CD45.1+受体
转录组和代谢表型分析
揭示PTEN依赖的转录程序和糖酵解/线粒体代谢平衡
微阵列比较WT与Ptenfl/flFoxp3-Cre Treg转录谱，GSEA和IPA分析；检测TCR/CD28刺激后糖酵解通量，以及ROS、线粒体质量和膜电位
mTORC1/mTORC2通路及Rictor敲除 rescue 验证
确定PTEN缺失主要激活的mTOR复合物及mTORC2在表型中的作用
免疫印迹检测短期（5-15 min）和长期（20 h，±IL-2）anti-CD3-CD28刺激后p-S6、p-4E-BP1、p-Akt(S473)和p-Foxo1；构建Ptenfl/flRictorfl/flFoxp3-Cre小鼠，检测Treg数量、CD25、TFH、GC B和肾脏IgG沉积
PTEN单倍剂量不足分析
检验PTEN部分功能缺失是否足以破坏免疫稳态
分析Ptenfl/+Foxp3-Cre小鼠的PTEN mRNA和蛋白水平、Treg数量、CD25、谱系追踪、TFH、GC B、生发中心、ANA和肾脏IgG沉积及淋巴结病
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 流式细胞术 | 抗CD4抗体（RM4-5） | eBioscience | RM4-5 |
| 抗CD8α抗体（53-6.7） | eBioscience | 53-6.7 | |
| 抗TCRβ抗体（H57-597） | eBioscience | H57-597 | |
| 抗CD69抗体（H1.2F3） | eBioscience | H1.2F3 | |
| 抗CD25抗体（PC61.5） | eBioscience | PC61.5 | |
| 抗CD44抗体（1M7） | eBioscience | 1M7 | |
| 抗CD62L抗体（MEL-14） | eBioscience | MEL-14 | |
| 抗CD45.1抗体（A20） | eBioscience | A20 | |
| 抗CD45.2抗体（104） | eBioscience | 104 | |
| 抗PD-1抗体（J43） | eBioscience | J43 | |
| 抗GL7抗体（GL-7） | eBioscience | GL-7 | |
| 抗CD95抗体（15A7） | eBioscience | 15A7 | |
| 抗ICOS抗体（C398.4A） | eBioscience | C398.4A | |
| 抗GITR抗体（DTA-1） | eBioscience | DTA-1 | |
| 抗CD19抗体（1D3） | eBioscience | 1D3 | |
| 抗CXCR3抗体（CXCR3-173） | eBioscience | CXCR3-173 | |
| 抗MHCII抗体（M5/114.15.2） | eBioscience | M5/114.15.2 | |
| 抗CD11b抗体（M1/70） | eBioscience | M1/70 | |
| 抗CD11c抗体（N418） | eBioscience | N418 | |
| 抗Ly6G抗体（RB6-8C5） | eBioscience | RB6-8C5 | |
| 生物素化抗CXCR5抗体（2G8） | BD Biosciences | 2G8 | |
| 链霉亲和素偶联PE | BD Biosciences | -- | |
| 抗Foxp3抗体（FJK-16s） | eBioscience | FJK-16s | |
| 抗T-bet抗体（4B10） | eBioscience | 4B10 | |
| 抗IRF4抗体（3E4） | eBioscience | 3E4 | |
| 抗IFN-γ抗体（XMG1.2） | eBioscience | XMG1.2 | |
| 抗IL-4抗体（11B11） | eBioscience | 11B11 | |
| 抗IL-17抗体（17B7） | eBioscience | 17B7 | |
| 抗CTLA4抗体（UC10-4B9） | BioLegend | UC10-4B9 | |
| 抗p-STAT3抗体（4/P-STAT3） | BD Biosciences | 4/P-STAT3 | |
| 抗PTEN抗体（A2B1） | BD Biosciences | A2B1 | |
| 抗Bcl6抗体（K112-91） | BD Biosciences | K112-91 | |
| 抗Blimp1抗体（3H2-E8） | Thermo Scientific | 3H2-E8 | |
| 佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 | eBioscience | -- | |
| 离子霉素 | eBioscience | -- | |
| 莫能菌素 | eBioscience | -- | |
| MitoTracker深红 | Life Technologies | -- | |
| 四甲基罗丹明甲酯 | ImmunoChemistry Technologies | -- | |
| MitoSOX红 | Life Technologies | -- | |
| 成像与免疫组化 | OCT包埋剂 | -- | -- |
| AF568偶联山羊抗小鼠抗体 | Life Technologies | -- | |
| AF568偶联驴抗山羊抗体 | Life Technologies | -- | |
| Cy5偶联驴抗山羊抗体 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| AF488偶联链霉亲和素 | Life Technologies | -- | |
| 含DAPI的Vectashield封片剂 | Vector Laboratories | -- | |
| 固定Hep-2玻片 | MBL | -- | |
| AF488偶联鬼笔环肽 | Life Technologies | -- | |
| 抗CD3抗体（sc-1127，M-20） | Santa Cruz | sc-1127 | |
| 生物素化花生凝集素 | Vector Laboratories | B-1075 | |
| 抗IgD抗体（558597） | BD Biosciences | 558597 | |
| 免疫接种 | NP14-OVA | Biosearch Technologies | -- |
| 脂多糖（大肠杆菌055:B5株） | Sigma | -- | |
| 绵羊红细胞 | Colorado Serum Company | 31112 | |
| 血清抗体检测 | dsDNA自身抗体检测试剂盒（5110） | Alpha Diagnostic International | 5110 |
| 免疫球蛋白亚类检测试剂盒（MGAMMAG-300K） | Millipore | MGAMMAG-300K | |
| RNA与免疫印迹 | 抗p-S6抗体（2F9） | Cell Signaling Technology | 2F9 |
| 抗p-4E-BP1抗体（236B4） | Cell Signaling Technology | 236B4 | |
| 抗p-Foxo1抗体（9461） | Cell Signaling Technology | 9461 | |
| Ser473磷酸化Akt抗体（D9E） | Cell Signaling Technology | D9E | |
| 抗PTEN抗体（138D6） | Cell Signaling Technology | 138D6 | |
| 抗β-actin抗体（AC-15） | Sigma | AC-15 | |
| 基因表达谱分析 | Affymetrix HT MG-430 PM Gene Titan peg芯片 | Affymetrix | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型与对照 | Ptenfl/flFoxp3-Cre小鼠除特别说明外使用10-12周龄，对照为年龄和性别匹配的含Foxp3cre等位基因WT小鼠 阅读提示：Methods中Mice小节 |
| 骨髓嵌合体 | Rag1−/−受体亚致死剂量5 Gy照射；转移7×10^6 T细胞去除骨髓细胞，供体与CD45.1+按1:1混合；重建至少2.5个月 阅读提示：Methods中Mice小节及Figure 4图注 |
| 免疫方案 | NP-OVA 100 μg与LPS 10 μg经明矾沉淀后腹腔注射；或静脉注射1×10^9 SRBC，7天后分析 阅读提示：Methods中Immunization小节及Figure 3图注 |
| 过继转移 | 供体为CD45.2+ CD4+CD25+Foxp3-YFP+细胞，受体为CD45.1+，转移7天后分析Foxp3和CD25 阅读提示：Methods中Cell purification and adoptive transfer小节及Figure 5图注 |
| 代谢检测 | 糖酵解：板结合anti-CD3-CD28刺激6 h，[3-3H]-葡萄糖去氚化检测；线粒体：10 nM MitoTracker Deep Red或20 nM TMRM 37°C 30 min，ROS用5 μM MitoSOX Red 阅读提示：Methods中Glycolysis assay及Flow cytometry小节、Figure 6图注 |
| mTOR通路免疫印迹 | anti-CD3-CD28刺激5-15 min或20 h（±IL-2）；检测p-S6、p-4E-BP1、p-Akt(S473)和p-Foxo1 阅读提示：Methods中RNA and immunoblot analysis小节及Figure 7图注 |
| 微阵列分析 | n=3 WT、3 Ptenfl/flFoxp3-Cre小鼠；1.5倍差异阈值；数据存入GSE63625 阅读提示：Methods中Gene expression profiling小节及Figure 6图注 |