鉴定STAT3为棕榈酸响应性KAT2A转录调控因子
探究棕榈酸是否通过STAT3调控KAT2A表达。
利用RNA-seq数据预测转录因子，在4T1等3D肿瘤球中补充棕榈酸，检测STAT3磷酸化和KAT2A表达，并通过Stat3沉默、STAT3抑制剂Stattic、IL-6激活及ChIP-qPCR验证。
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棕榈酰化介导的KAT2A调控促进乳腺癌肺转移
Palmitoylation-mediated regulation of KAT2A promotes lung metastasis in breast cancer.
实验完整度
高包含体外3D肿瘤球、多种细胞系、小鼠转移模型及患者肺转移样本，并有功能与机制验证
主要模型
4T1小鼠乳腺癌细胞3D肿瘤球 EMT6.5小鼠乳腺癌细胞3D肿瘤球 MCF10A H-RasV12人乳腺细胞3D肿瘤球 BALB/c小鼠乳腺癌转移模型
重点核对
棕榈酸补充浓度75 μM（终浓度130 μM） shRNA介导的Zdhhc20、Tm4sf1、Stat3、Ddr1、Jak2敲低 Tm4sf1 C79A+C88A双突变体 小鼠尾静脉注射1×105细胞或乳腺脂肪垫注射5×104细胞 高脂饮食喂养16周
摘要
乙酰化在癌症中常失调，乙酰转移酶和去乙酰化酶抑制剂正处于不同阶段的临床前和临床开发中。然而，乙酰转移酶和去乙酰化酶的表达调控机制往往难以捉摸。我们聚焦于赖氨酸乙酰转移酶2A（KAT2A），因其在多种癌症适应症中重要且已有临床抑制剂在研发中。我们发现KAT2A表达在乳腺癌来源的转移灶中受棕榈酰化调控。具体而言，我们发现棕榈酰转移酶DHHC20（基因名ZDHHC20）棕榈酰化跨膜4L六家族成员1（TM4SF1），促进其质膜定位。这进而促进信号转导和转录激活因子3（STAT3）的磷酸化，我们鉴定STAT3为KAT2A的转录调控因子。相应地，Zdhhc20和Tm4sf1沉默以及表达Tm4sf1双棕榈酰化突变体均降低肺转移生长，而Kat2a表达可挽救此表型。我们在乳腺癌患者的肺转移样本中检测到这种棕榈酰化诱导的KAT2A调控的证据。因此，我们表明棕榈酰化可以协调肺转移中全局乙酰化调控因子的表达。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- KAT2A在乳腺癌转移中的表达如何被转录调控，以及棕榈酰化是否参与该过程。
- 核心机制
- DHHC20棕榈酰化TM4SF1促进其质膜定位，进而激活STAT3磷酸化，STAT3作为转录因子调控KAT2A表达，促进转移生长。
- 主要证据
- 体外3D肿瘤球实验显示棕榈酸通过DHHC20-TM4SF1-STAT3轴上调KAT2A；小鼠转移模型表明Zdhhc20沉默或Tm4sf1棕榈酰化突变减少肺转移，Kat2a过表达可挽救；患者肺转移样本中DHHC20、p-STAT3和KAT2A表达升高。
- 研究意义
- 揭示了棕榈酰化与乙酰化在转移生长中的交汇，提示靶向DHHC20介导的棕榈酰化可减少转移生长，并可能为STAT3抑制剂临床试验提供基于循环棕榈酸水平的患者选择标准。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定DHHC20为棕榈酸诱导STAT3活性的关键棕榈酰转移酶
筛选并验证介导棕榈酸诱导STAT3磷酸化的棕榈酰转移酶。
比较3D与2D培养中ZDHHC家族表达，筛选上调基因，通过shRNA沉默Zdhhc20，检测STAT3磷酸化、KAT2A表达、spheroid生长及STAT3启动子结合。
验证DHHC20对KAT2A活性的影响
探究DHHC20是否影响KAT2A介导的p65乙酰化。
在Zdhhc20沉默的4T1肿瘤球中检测p65乙酰化，并通过Kat2a过表达进行挽救实验。
鉴定TM4SF1为DHHC20的棕榈酰化底物
寻找DHHC20调控STAT3磷酸化的中介蛋白。
通过ABE实验检测STAT3棕榈酰化，利用公共棕榈酰化数据集筛选TM4SF1，验证DHHC20与TM4SF1相互作用、TM4SF1棕榈酰化及质膜定位。
确定TM4SF1棕榈酰化位点及其功能
鉴定DHHC20棕榈酰化TM4SF1的具体半胱氨酸位点，并验证其对质膜定位和STAT3信号的影响。
利用AlphaFold3预测Cys79和Cys88，构建单突变和双突变体，通过ABE和免疫荧光检测棕榈酰化及膜定位，并在Tm4sf1沉默细胞中回补突变体检测STAT3磷酸化和KAT2A表达。
验证TM4SF1棕榈酰化对STAT3-KAT2A轴的必要性
确定TM4SF1棕榈酰化是否通过DDR1-JAK2轴调控STAT3磷酸化和KAT2A表达。
在4T1、EMT6.5、HCC70、MCF10A H-RasV12肿瘤球中沉默Ddr1、Jak2或Tm4sf1，检测STAT3磷酸化和KAT2A表达；使用JAK2和PKC抑制剂；在Zdhhc20沉默细胞中过表达野生型Tm4sf1。
评估棕榈酰化对体内肺转移生长的影响
验证DHHC20和TM4SF1棕榈酰化在体内转移生长中的作用。
将Zdhhc20沉默或Tm4sf1棕榈酰化突变体表达的4T1/EMT6.5细胞通过尾静脉或乳腺脂肪垫注射入BALB/c小鼠，检测肺转移负荷；并通过Kat2a或Zdhhc20过表达进行挽救；同时在高脂饮食模型中验证。
在乳腺癌患者样本中验证棕榈酰化-KAT2A轴
检测患者肺转移样本中DHHC20、p-STAT3和KAT2A的表达及相关信号通路。
收集UPTIDER项目4例乳腺癌患者肺转移组织，多重免疫组化检测蛋白表达；利用公共数据分析DDR1和STAT3信号特征。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- | |
| DMEM/F12培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 氢化可的松 | -- | -- | |
| 霍乱毒素 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 重组人表皮生长因子 | -- | -- | |
| MycoAlert检测试剂盒 | Lonza | -- | |
| 药物处理 | 重组IL-6 | Proteintech | HZ-1019 |
| 重组IL-6 | R&D Systems | 406-ML | |
| Fedratinib | MedChemExpress | HY-10409 | |
| Go 6983 | MedChemExpress | HY-13689 | |
| STATTIC | MedChemExpress | HY-13818 | |
| 棕榈酸钠 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 硬脂酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 油酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 2-溴棕榈酸 | -- | -- | |
| 质粒构建 | Lipofectamine 2000 | -- | -- |
| pLVX-IRES-Hyg | Takara Bio | 632182 | |
| GeneJET凝胶回收试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Gibson组装预混液 | New England Biolabs | -- | |
| DH5α感受态细胞 | NEB | -- | |
| 蛋白纯化 | 链霉亲和素树脂 | Thermo Scientific | -- |
| Superdex 200 Increase 5/150色谱柱 | Cytiva | -- | |
| 免疫组化 | BOND抗原修复液2 | -- | AR9640 |
| Opal荧光团工作液 | Akoya Biosciences | -- | |
| DAPI | Akoya | -- | |
| Immu-Mount封片剂 | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 免疫荧光 | 磷酸化STAT3（Y705）抗体 | Cell Signaling | 9198 |
| STAT3抗体 | Proteintech | 10253-2-AP | |
| Alexa Fluor 555标记二抗 | Life Technologies | A31272 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 荧光封片剂 | Dako | S3023 | |
| 流式细胞术 | 抗小鼠CD16/CD32（Fc封闭） | BD Biosciences | -- |
| 抗CD45抗体 | BD Biosciences | 550994 | |
| 抗PDPN抗体 | BioLegend | 127409 | |
| 抗CD90.1抗体 | BioLegend | 202505 | |
| 活力染料eFluor450 | Thermo Fisher | 65-0863-14 | |
| 抗小鼠TM4SF1抗体 | R&D systems | AF7514 | |
| 绵羊IgG同型对照 | R&D systems | 5-001-A | |
| 抗绵羊488二抗 | Abcam | ab150177 | |
| 体外结合实验 | Protein A/G磁珠 | Invitrogen | 10008D |
| 抗DDR1抗体 | Proteintech | 10536-1-AP | |
| 重组DDR1蛋白 | Bio-Connect | HY-P77639 | |
| Western blot | KAT2A抗体 | Cell Signaling | 3305 |
| DHHC20抗体 | Sigma | HPA014702 | |
| 磷酸化STAT3（Y705）抗体 | Cell Signaling | 9145 | |
| STAT3抗体 | Cell Signaling | 9139 | |
| STAT3抗体 | Proteintech | 10253-2-AP | |
| Flag抗体 | Proteintech | 20543-1-AP | |
| NF-κB p65乙酰化抗体 | Abcam | ab19870 | |
| NF-κB p65抗体 | Cell Signaling | 8242S | |
| 组蛋白H3抗体 | Abcam | ab1791 | |
| Vinculin抗体 | Cell Signaling | 13901S | |
| β-ACTIN抗体 | Sigma | A5441 | |
| 小鼠二抗 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 兔二抗 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物 | Invitrogen | 34580 | |
| SuperSignal West Femto最高灵敏度底物 | Invitrogen | 34095 | |
| Western Blot剥离缓冲液 | Thermo Fisher | 46430 | |
| RT-qPCR | qScript cDNA合成试剂盒 | -- | -- |
| PerfeCTa SYBR Green预混液，低ROX | -- | -- | |
| ABE实验 | Flag抗体 | Proteintech | 20543-1-AP |
| ChIP-qPCR | 抗STAT3 ChIP抗体 | Cell Signaling | 9139 |
| 抗STAT3 ChIP抗体 | Proteintech | 10253-2-AP | |
| 抗兔IgG | Cell Signaling | 2729 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 3D肿瘤球培养与脂肪酸处理 | 棕榈酸、油酸、硬脂酸的终浓度均为130 μM（添加量分别为75 μM、116 μM、75 μM），溶剂对照含0.125%乙醇，脂肪酸与BSA比例至少3:1 阅读提示：Methods中“Reagents and Free Fatty Acid (FFA) Preparation”及Figure 1 legend |
| 基因敲低与过表达 | shRNA靶向Zdhhc20、Tm4sf1、Stat3、Ddr1、Jak2的序列及验证效率；puromycin筛选浓度（4T1 2 μg/ml，EMT6.5 1 μg/ml，MCF10A H-RasV12 0.3 μg/ml）；潮霉素筛选浓度（4T1 100 μg/ml，EMT6.5 500 μg/ml） 阅读提示：Methods中“Generation of Genetically Modified Cell Lines”及Extended Data Figure 6 |
| 小鼠转移模型 | 小鼠品系（BALB/c，雌性，6–8周龄），细胞接种数量（尾静脉1×105，乳腺脂肪垫5×104），观察时间（尾静脉13天，乳腺脂肪垫25天），随机化和盲法 阅读提示：Methods中“Animal Studies”及Figure 5 legend |
| 高脂饮食模型 | 高脂饮食成分（60%脂肪，20%蛋白质，20%碳水化合物），对照饮食成分（13%脂肪，27%蛋白质，60%碳水化合物），喂养16周 阅读提示：Methods中“High fat diet mouse model”及Figure 5 legend |
| 患者样本分析 | UPTIDER项目肺转移样本（n=4），多重免疫组化抗体稀释和染色条件，定量方法（荧光强度/面积） 阅读提示：Methods中“UPTIDER samples”和“Multiplex immunohistochemistry staining”及Figure 6 legend |