开发ribo-spike方法并测量ISR翻译程序
实现核糖体图谱中样本间绝对翻译效率变化的监测
构建含fLuc mRNA的兔网状红细胞裂解物体外翻译系统作为ribo-spike，加入样本后进行核糖体图谱和RNA测序，比较未应激与亚砷酸钠或热休克应激细胞的翻译效率。
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G3BP应激颗粒蛋白强化整合应激反应翻译程序
The G3BP stress-granule proteins reinforce the integrated stress response translation programme.
实验完整度
高包含核糖体图谱、光遗传学、多细胞系及应激模型，并有功能回补与机制验证
主要模型
HCT116细胞系 G3BP1/2敲除或降解的HCT116细胞 表达GFP::CRY2::G3BPΔN的HCT116细胞 应激颗粒核心纯化样本
重点核对
使用ribo-spike（兔网状红细胞裂解物体外翻译fLuc mRNA）进行核糖体图谱绝对定量 G3BP1/2的AID降解（500 µM IAA处理3小时）效率>90% 亚砷酸钠应激条件：500 µM处理1小时 热休克应激条件：45°C处理25分钟 应激颗粒核心纯化使用G3BP2抗体免疫沉淀
摘要
当哺乳动物细胞暴露于应激时，它们通过G3BP1和G3BP2（G3BPs）蛋白的作用协调应激颗粒（SGs）的凝聚，同时经历翻译的大规模减少。尽管SGs和G3BPs与这种翻译反应有关，但它们的整体影响尚不清楚。在这里，我们研究了G3BPs和SGs如何以及是否塑造应激翻译反应的问题。我们发现SGs富集了对应激诱导的翻译关闭具有抗性的mRNAs。尽管这些抗应激mRNAs的准确招募确实需要应激环境，但光遗传学工具和 spike-normalized 核糖体图谱的组合表明，G3BPs和SGs对于帮助优先翻译其富集的mRNAs和帮助抑制胞质翻译既是必要的也是充分的。总之，这些结果支持一个模型，其中G3BPs和SGs通过优先翻译其驻留的mRNAs来强化应激翻译程序。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- G3BPs和应激颗粒如何、以及是否影响应激条件下的翻译反应？
- 核心机制
- G3BPs和SGs通过优先翻译其富集的mRNAs来强化ISR翻译程序；SG的转录组招募需要应激条件重塑RNA结合景观。
- 主要证据
- 核糖体图谱显示G3BP依赖的翻译变化与ISR翻译程序正相关（RS=0.33），SG富集的mRNA在应激下翻译更优；光遗传学诱导的OGs仅引起温和全局翻译下降但不指定ISR程序，而SOGs招募的转录组与SG相似；将报告mRNA系连至SG赋予其抗ISR翻译关闭的能力。
- 研究意义
- 提出SGs既非ISR所必需也非无功能凝聚体，而是可测量地增强和强化ISR翻译程序，对全局翻译产生广泛但相对温和的影响。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
G3BP降解对ISR翻译程序的影响
确定G3BPs和SGs对应激翻译反应的作用
构建G3BP1/2双端AID标签的HCT116细胞，IAA处理诱导降解，核糖体图谱比较有/无G3BP的细胞在应激和未应激条件下的翻译效率。
应激颗粒核心的纯化与转录组分析
鉴定SG富集的mRNA并分析其与ISR翻译调控的关系
从亚砷酸钠处理的HCT116细胞中纯化SG核心，进行RNA测序，计算SG富集值，并与ISR翻译类别和G3BP依赖翻译变化关联。
光遗传学诱导应激颗粒样凝聚体（OGs）
测试SG样凝聚是否足以驱动ISR样翻译反应
在HCT116细胞中表达多西环素诱导的GFP::CRY2::G3BPΔN，蓝光照射诱导OGs形成，核糖体图谱比较OG诱导细胞与蓝光对照细胞的翻译效率，并与ISR和G3BP依赖翻译程序比较。
应激条件下OGs（SOGs）的纯化与转录组比较
确定OGs是否需要应激才能招募SG转录组
在表达AID::RFP::G3BPs和诱导型OsTIR1的细胞中，用多西环素和IAA降解内源G3BPs并表达GFP::CRY2::G3BPΔN，应激和蓝光诱导SOGs，纯化OGs、SOGs和对照SGs进行RNA测序比较。
将报告mRNA系连至SG并测量翻译
验证定位到SG是否赋予mRNA抗ISR翻译关闭的能力
构建含24×MS2茎环和NanoLuc报告基因的mRNA，通过MCP融合的G3BP1或CAPRIN1系连至SG，用荧光素酶报告基因检测翻译效率，smFISH检测SG定位，多聚核糖体图谱分析核糖体负载。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 核糖体图谱spike制备 | mMessage mMachine试剂盒 | Thermo | AM1344 |
| 兔网状红细胞裂解物系统 | Promega | L4151 | |
| TURBO DNA酶 | -- | -- | |
| Sybr Gold核酸染料 | Thermo | S11494 | |
| 蛋白降解 | 吲哚-3-乙酸 | Gold Bio | I-110-25 |
| auxinole | Aobious | AOB8812 | |
| 多西环素诱导 | 多西环素 | Clonetech Takara Bio | 631311 |
| 细胞系构建 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo | L3000015 |
| 超级PiggyBac转座酶表达载体 | System Biosciences | PB210PA-1 | |
| 荧光素酶检测 | 荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 |
| GloMax微板读板仪和发光检测仪 | Promega | GM3000 | |
| RT-qPCR | TRI试剂 | Sigma | 93289 |
| Quantitect逆转录试剂盒 | -- | -- | |
| PowerUP SYBR Green qPCR预混液 | -- | -- | |
| QuantStudio 6 Pro实时荧光定量PCR系统 | Thermo | -- | |
| 蓝光照射 | LED植物生长灯系统（225×14 W蓝色LED） | HQRP | 884667106091218 |
| 免疫荧光 | Nunc细胞培养处理多孔板 | Thermo | 140675 |
| 含DAPI的Vectashield封片剂 | Vectashield | H-2000-10 | |
| smFISH | 玻璃底24孔板 | MatTek Corporation | P24G-1.5-10-F |
| Western blot | NuPAGE LDS样本缓冲液 | Thermo | NP0007 |
| NuPAGE 4–12% Bis–Tris 1.0 mm迷你蛋白凝胶 | Thermo | NP0321BOX | |
| PVDF转印膜 | Thermo | 22860 | |
| 迷你凝胶槽 | Thermo | A25977 | |
| Odyssey CLx成像系统 | LI-COR | -- | |
| cOmplete迷你片剂（无EDTA） | -- | -- | |
| 应激颗粒纯化 | G3BP2抗体 | Bethyl Laboratories | A302-040A |
| M-280羊抗兔IgG磁珠 | Thermo | 11204D | |
| 多聚核糖体图谱 | BioComp梯度分馏仪 | BioComp | -- |
| RNasin Plus RNA酶抑制剂 | -- | -- | |
| 26 G 0.5英寸针头 | -- | -- | |
| 10–50%蔗糖梯度 | -- | -- | |
| 核糖体图谱 | Illumina HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| ribo-spike制备与标准化 | fLuc mRNA浓度0.06 µM、兔网状红细胞裂解物体外翻译30°C 15分钟、反应体系中各组分浓度 阅读提示：Methods中Ribo-spike production小节 |
| G3BP降解 | IAA浓度500 µM、处理时间3小时、OsTIR1诱导条件（多西环素1 µg/ml预处理4小时） 阅读提示：Methods中IAA-induced protein depletion小节 |
| 应激处理 | 亚砷酸钠500 µM处理1小时；热休克45°C处理25分钟 阅读提示：Methods中Stress conditions小节 |
| 光遗传学OG诱导 | 多西环素1 µg/ml诱导时间、蓝光488 nm照射3小时、OG形成率约80% 阅读提示：Results中OGs相关段落及Fig. 4a,b图注 |
| 报告基因系连实验 | 亚砷酸钠500 µM时间程0-90分钟、多西环素1 µg/ml、IAA 500 µM、auxinole 200 µM、报告基因5′和3′UTR来源（CNOT10、DDIT4L、RB1） 阅读提示：Methods中Tethered reporter TE experiments小节及Fig. 6图注 |
| 多聚核糖体图谱 | 蔗糖梯度10–50%、离心36,000 rpm 2小时4°C、收集12个组分、每个组分加入0.1 fmol体外转录RNA标准品 阅读提示：Methods中Polysome profiling小节 |
| 应激颗粒核心纯化 | 亚砷酸钠500 µM处理1小时、G3BP2抗体6 µg、M-280羊抗兔IgG磁珠625 µl、高盐洗脱缓冲液组成 阅读提示：Methods中Isolation of RNA from HCT116 cells and SG cores for RNA sequencing小节 |