构建可降解三敲除小鼠ESC体系
建立可在1小时内急性降解全部三种H3K9me3 KMTs的细胞模型，以高时间分辨率研究H3K9me3异染色质动态。
从cTKO小鼠ESC出发，在Suv39h2纯合缺失背景中对Suv39h1敲入mini-IAA7、对Setdb1敲入dTAG，并将atAFB2敲入TIGRE安全港位点，获得dTKO细胞；验证多能性标志物表达、嵌合体分化能力和H3K9me3 ChIP信号与亲本细胞一致。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
不同的H3K9me3异染色质维持动态调控多能细胞中的不同基因程序和重复序列
Distinct H3K9me3 heterochromatin maintenance dynamics govern different gene programmes and repeats in pluripotent cells.
实验完整度
高构建dTKO小鼠ESC，结合 degron降解、ChIP-seq/ATAC-seq/TT-seq、质谱、数学建模及siRNA敲低进行功能与机制验证
主要模型
dTKO小鼠胚胎干细胞（Suv39h2敲除背景，Suv39h1-IAA7和Setdb1-dTAG标记） 亲本cTKO小鼠胚胎干细胞
重点核对
auxin 100 μg/ml与dTAG13 0.5 μM处理降解时间进程（0、1、3、6、12、24、48小时） 1 mM thymidine处理6小时阻断DNA合成以区分被动稀释 QC6352 100 nM抑制KDM4或KDM4A-C siRNA敲低（各6.7 nM） NFYA siRNA敲低3天后进行降解时间进程 Dppa2 siRNA敲低3天后进行降解时间进程
摘要
由赖氨酸甲基转移酶（KMTs）建立并由HP1亚型压缩的H3K9me3异染色质抑制替代谱系基因和DNA重复序列。目前对H3K9me3异染色质稳定性的理解局限于单个结构域和DNA重复序列。我们工程化改造了Suv39h2敲除小鼠胚胎干细胞，使其在一小时内降解剩余两种H3K9me3-KMTs，发现被动稀释和主动移除均参与H3K9me3在12–24小时内的衰减。我们在全基因组范围内发现了四种不同的H3K9me3衰减速率，以及可预测稳定性类别的染色质特征和转录因子结合模式。一个“二元开关”控制异染色质压缩，当KMTs耗竭时HP1迅速从异染色质解离，且HP1的特定阈值水平限制了先锋因子结合、染色质开放和在12小时内退出多能性。出乎意料的是，消退的H3K9me3结构域揭示了富含异染色质诱导蛋白的残留HP1β峰。我们的发现揭示了不同的H3K9me3异染色质维持动态调控基因网络和重复序列，共同保障多能性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- H3K9me3异染色质在哺乳动物多能细胞全基因组范围内的维持稳定性基础是什么，不同基因组区域维持机制是否存在差异，以及哪些特征赋予差异稳定性。
- 核心机制
- H3K9me3衰减由被动复制稀释和KDM4介导的主动移除共同驱动；HP1的阈值水平作为“二元开关”控制异染色质压缩，HP1快速解离至阈值以下使先锋因子（NFYA、OCT4、KLF4）结合并开放染色质；不同染色质状态（ChromHMM状态1–4）决定四种H3K9me3稳定性类型。
- 主要证据
- dTKO小鼠ESC中双degron一小时内降解KMTs，Western blot和质谱显示H3K9me3在12小时损失约55%、24小时约90%；thymidine阻断和KDM4敲低/抑制延长半衰期；spike-in ChIP-seq、ATAC-seq和TT-seq揭示四种衰减簇及HP1阈值依赖的染色质开放和转录激活；NFYA和Dppa2敲低验证其对重复序列激活的作用。
- 研究意义
- 揭示不同H3K9me3异染色质维持动态调控基因网络和重复序列以共同保障多能性，扩展了对单一位点研究和常规遗传删除之外H3K9me3维持与重塑原理的理解，并提示可据此调控细胞分化状态。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
急性降解KMTs并测定H3K9me3衰减动力学
确定KMTs降解后H3K9me3的衰减速率及被动稀释与主动移除的相对贡献。
用auxin和dTAG13同时处理dTKO细胞，Western blot检测染色质组分中SETDB1-HA、SUV39H1-V5、H3K9me3和组蛋白H3；质谱分析酸提组蛋白和染色质组分；通过thymidine阻断DNA合成及KDM4A-C敲低或QC6352抑制评估被动稀释和主动移除的贡献。
全基因组分析H3K9me3与HP1β动态
在全基因组水平解析H3K9me3和HP1β的衰减动力学及染色质开放和转录激活的关系。
进行spike-in归一化H3K9me3和HP1β ChIP-seq、ATAC-seq、TT-seq及染色质组分质谱，选取1、3、12、24、48小时时间点分析结构域水平变化、衰减速率拟合及残留HP1β峰。
划分H3K9me3稳定性类型并建立数学与ChromHMM模型
根据H3K9me3丢失时序划分稳定性簇，并用数学模型和染色质状态模型解释不同稳定性的决定因素。
基于相对丢失时间将H3K9me3结构域分为early（1498个）、intermediate（30660个）、late（8772个）和residual（1960个）四簇；拟合指数衰减模型；构建K+/K-数学模型模拟初始水平和衰减速率；用16状态ChromHMM模型分析染色质特征与衰减速率的关系。
验证HP1阈值与先锋因子在染色质开放和基因激活中的作用
检验HP1阈值水平如何控制染色质压缩，以及先锋因子结合是否促进H3K9me3进一步丢失和基因/重复序列激活。
比较H3K9me3或HP1β信号与ATAC信号的相关性及阈值；ATAC footprinting分析转录因子结合；ChIP-qPCR检测OCT4结合；NFYA siRNA敲低后Western blot检测H3K9me3并RT-qPCR检测MMERVK10C；Dppa2 siRNA敲低后检测L1Md_T和总LINE1转录水平。
评估H3K9me3对多能性维持和分化基因的调控
确定H3K9me3丢失对干细胞自我更新、谱系基因和重复序列表达的影响。
进行碱性磷酸酶染色评估自我更新能力；TT-seq分析激活的蛋白编码基因和转座元件；比较与已发表HP1 TKO数据的重叠；分析下调基因的Dppa2结合和H3K27me3变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| GlutaMAX添加剂 | -- | -- | |
| MEM非必需氨基酸 | -- | -- | |
| ESGRO白血病抑制因子 | -- | -- | |
| PD0325901 | -- | -- | |
| CHIR99021 | -- | -- | |
| 细胞传代 | TryLE胰蛋白酶样酶 | Thermo | 12605010 |
| TryPLE酶 | -- | -- | |
| 细胞培养 | Lipofectamine 3000转染试剂 | -- | -- |
| 细胞筛选 | 杀稻瘟菌素S盐酸盐 | Thermo | R21001 |
| 质粒构建 | Gibson组装试剂盒 | NEB | E2611 |
| eSpCas9(1.1)质粒 | addgene | 71814 | |
| 蛋白降解处理 | 生长素 | -- | -- |
| dTAG13降解剂 | -- | -- | |
| 细胞周期阻断 | 胸苷 | -- | -- |
| EdU检测 | Click-iT EdU细胞增殖检测试剂盒 | Thermo | C10337 |
| 流式分析 | BD Accuri C6流式细胞仪 | BD | -- |
| KDM4抑制 | QC6352 | MedChemExpress | HY-104048 |
| KDM4A-C敲低 | KDM4A SMARTpool siRNA | Dharmacon | 230674 |
| KDM4B SMARTpool siRNA | Dharmacon | 193796 | |
| KDM4C SMARTpool siRNA | Dharmacon | 76804 | |
| Silencer Select非靶向对照siRNA | Thermo | 4390843 | |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo | 13778150 |
| 蛋白提取 | Trizol试剂 | Thermo | 15596026 |
| Western blot | LDS样品缓冲液 | Thermo | NP0008 |
| 样品还原剂 | Thermo | NP004 | |
| H3K9me3抗体 | Abcam | ab8898 | |
| 组蛋白H3抗体 | Abcam | ab1791 | |
| H4K20me3抗体 | Millipore | 07-463 | |
| H3K9me2抗体 | Abcam | ab1120 | |
| H3K27me3抗体 | Millipore | 07-449 | |
| NF-YA抗体 | Santa Cruz | sc-17753 | |
| α-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2144 | |
| Dppa2抗体 | Millipore | MAB4356 | |
| Kdm4a抗体 | Thermo Fisher | PA5-14782 | |
| Kdm4b抗体 | Bethyl | A301-478A | |
| HP1α抗体 | Cell Signaling Technology | 2616 | |
| HP1β抗体 | Cell Signaling Technology | 8676 | |
| HP1γ抗体 | Cell Signaling Technology | 2619 | |
| Mpp8抗体 | Proteintech | 16796-1-AP | |
| TRIM28抗体 | Abcam | ab22553 | |
| YTHDC1抗体 | Cell Signaling Technology | 77422 | |
| Mettl3抗体 | Bethyl | A301-567A | |
| HA抗体 | BioLegend | 901533 | |
| V5抗体 | eBioscience | 14-6796-82 | |
| Suv39h1抗体 | Thermo Fisher | 702443 | |
| Setdb1抗体 | Proteintech | 11231-1-AP | |
| 驴抗小鼠HRP二抗 | Jackson ImmunoResearch laboratories | 715-035-150 | |
| 驴抗兔HRP二抗 | Jackson ImmunoResearch laboratories | 711-035-152 | |
| 驴抗山羊HRP二抗 | Jackson ImmunoResearch laboratories | 705-035-003 | |
| 质谱样品制备 | Pierce C18吸头 | Thermo Scientific | -- |
| ChIP-seq | 果蝇spike-in染色质 | -- | -- |
| Protein A/G磁珠 | -- | -- | |
| H4K20me3抗体 | Abcam | ab8896 | |
| Dppa2/4抗体 | R&D Systems | AF3730 | |
| Qubit高灵敏度DNA检测试剂盒 | -- | -- | |
| ChIP-seq建库 | NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒 | NEB | E7645 |
| Ampure XP磁珠 | -- | -- | |
| 高灵敏度D1000 DNA ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | |
| Agilent Tapestation 4150 | Agilent | -- | |
| ATAC-seq | Zymo DNA纯化浓缩试剂盒 | Zymo | D4014 |
| TT-seq | 4-硫尿苷 | Glentham Life Sciences | GN6085 |
| 4-硫尿嘧啶 | Sigma | 440736 | |
| MTSEA生物素-XX连接子 | Biotium | BT90066 | |
| μMACS链霉亲和素微珠 | Miltenyi | 130-074-101 | |
| μMACS磁力分离器 | Miltenyi | 130-042-602 | |
| MACS多支架 | Miltenyi | 130-042-303 | |
| RNeasy MinElute纯化试剂盒 | Qiagen | 74204 | |
| TT-seq建库 | NEBNext Ultra II定向RNA文库构建试剂盒 | NEB | E7760 |
| 质谱分析 | QExactive HF质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 超声打断 | Covaris超声破碎仪 | Covaris | -- |
| 测序 | Illumina NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| KMTs急性降解与H3K9me3衰减时间进程 | auxin终浓度100 μg/ml、dTAG13终浓度0.5 μM、处理时间点0/1/3/6/12/24/48小时、超过24小时需每日补充degron 阅读提示：Methods中Mouse ESC derivation, culture, and maintenance小节及Fig. 1b图注 |
| 被动稀释与主动移除的区分 | 1 mM thymidine处理6小时、每24小时补充、EdU掺入验证DNA合成阻断；KDM4A-C siRNA各6.7 nM或QC6352 100 nM预处理2天 阅读提示：Methods中Thymidine treatment and KDM4 inhibition or knockdown小节及Fig. 1e–h图注 |
| HP1β和H3K9me3 ChIP-seq的spike-in归一化 | 20 μg小鼠染色质加12.5 ng Drosophila spike-in染色质、H3K9me3抗体0.5 μg、HP1β抗体1 μg 阅读提示：Methods中Chromatin Immunoprecipitation小节 |
| ATAC-seq和TT-seq时间点与重复 | ATAC-seq含0/3/6/12/24/48小时、TT-seq含0/3/12/24/48小时、生物学重复三次、4SU 1 mM标记10分钟 阅读提示：Methods中ATAC-seq和TT-seq小节及Fig. 2a图注 |
| NFYA和Dppa2敲低验证 | siRNA处理3天后进行降解时间进程、RT-qPCR以TBP为内参、生物学重复三次 阅读提示：Methods中Thymidine treatment and KDM4 inhibition or knockdown小节、Fig. 7a–b、8h–i图注 |
| 数学建模与ChromHMM参数 | K+/K-模型参数扫描范围及模拟重复次数、四簇结构域数量、16状态ChromHMM所用数据集 阅读提示：Methods中Mathematical modeling of H3K9me3 decay和ChromHMM modeling小节及Fig. 3d–e图注 |