阻断溶酶体功能与蛋白水解
验证基础溶酶体蛋白水解是否负责mTORC1的溶酶体募集。
用BafA1、ConA、CQ或PepA+E64处理HEK293FT和MEF，检测LC3B、p62积累及mTOR/LAMP2共定位与底物磷酸化。
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不同氨基酸来源下mTORC1信号的空间与功能分离
Spatial and functional separation of mTORC1 signalling in response to different amino acid sources.
实验完整度
高涵盖HEK293FT、MEF、SW-620等多细胞模型，结合药理学抑制、CRISPR KO、溶酶体IP、免疫EM、体外激酶及RNA-seq功能验证
主要模型
HEK293FT细胞 RagA/B或RagC/D敲除HEK293FT细胞 野生型与RagA/B敲除MEF SW-620结直肠癌细胞
重点核对
BafA1处理浓度100 nM、6 h（部分时间过程1–8 h），PepA 50 μM+E64 25 μM处理16 h 氨基酸饥饿1 h、add-back 10或30 min，及缺失特定氨基酸组（–MLIGV、–HRK、–STC）1 h RagA/B或RagC/D敲除、GNPTAB或LAMTOR1敲低对mTOR/LAMP2共定位与底物磷酸化的影响 Torin1 250 nM 1 h、rapamycin 20 nM时间过程作为mTOR抑制对照 共定位定量每条件约50个细胞、3–5个独立视野，报告均值±s.e.m.
摘要
氨基酸（AA）可用性通过控制雷帕霉素机制性/哺乳动物靶蛋白复合物1（mTORC1）活性，是细胞生长的强决定因素。按照该领域的主流模型，氨基酸充足通过异二聚体Rag GTP酶驱动mTORC1在溶酶体表面的募集和激活，mTORC1由此协调大多数细胞过程。然而，重要的是，所提出的mTORC1溶酶体调控的目的论，以及mTORC1作用于其效应蛋白的场所，仍不清楚。在此，我们使用多种药理学和遗传学手段扰乱溶酶体氨基酸感知和蛋白质回收机制，描述了哺乳动物细胞中mTORC1调控与下游功能的空间分离，溶酶体和非溶酶体mTORC1响应不同氨基酸来源而磷酸化不同底物。此外，我们发现，一部分mTOR定位于溶酶体，这是由基础溶酶体蛋白水解局部提供新的氨基酸所致，即使在细胞外营养物存在下生长的细胞中也是如此，而细胞质mTORC1则受外源氨基酸调控。总体而言，我们的研究大幅扩展了关于氨基酸调控mTORC1拓扑结构的认识，并提示存在独立的、不依赖Rag和溶酶体的机制，在其他亚细胞位置控制其活性。鉴于mTORC1信号和氨基酸感知对人类衰老和疾病的重要性，我们的发现可能为鉴定功能特异性mTORC1调控因子铺平道路，从而在未来为mTORC1活性失调相关病症突显更有效的药物发现靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- mTORC1是否仅在溶酶体表面被氨基酸激活并作用于所有底物，还是溶酶体与非溶酶体mTORC1存在空间和功能分工。
- 核心机制
- 基础溶酶体蛋白水解局部产生氨基酸，驱动mTORC1募集至溶酶体并激活溶酶体底物（TFEB/TFE3、RagC）；外源氨基酸则调控非溶酶体mTORC1对其非溶酶体底物（S6K、4E-BP1等）的活性，后者不依赖Rag和溶酶体。
- 主要证据
- 在HEK293FT、MEF和SW-620中，BafA1、ConA、CQ、PepA+E64、GNPTAB或LAMTOR1缺失及Rag KO均使mTOR离开溶酶体并降低TFEB/TFE3磷酸化，而S6K、4E-BP1、ULK1、GRB10、S6和GRASP55磷酸化基本不受影响；lyso-IP显示S6K不在溶酶体组分，体外激酶实验显示Rag缺失不降低mTORC1对4E-BP1的活性。
- 研究意义
- 扩展了对氨基酸调控mTORC1拓扑结构的认识，提示存在独立的、不依赖Rag和溶酶体的机制，可能有助于鉴定功能特异性mTORC1调控因子及针对mTORC1活性失调病症的药物靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
遗传学扰乱溶酶体酶分选与Rag锚定
独立验证溶酶体功能与Rag介导的募集对mTORC1底物特异性的作用。
用siRNA或CRISPR KO去除GNPTAB、RagA/B、RagC/D或敲低LAMTOR1，检测mTOR定位、底物磷酸化及溶酶体酶加工。
溶酶体与非溶酶体组分的生化分离
确认mTORC1及底物在溶酶体和非溶酶体组分的分布。
在稳定表达HA-TMEM192（对照FLAG-TMEM192）的细胞中进行抗HA lyso-IP，免疫印迹检测mTOR、Raptor、S6K和磷酸化TFEB。
免疫电镜定位验证
以高分辨亚细胞定位独立验证Rag缺失时mTOR的非溶酶体定位。
在WT或RagA/B KO MEF中，用抗mTOR（10 nm金颗粒）和抗LAMP2（5 nm金颗粒）进行免疫电镜并定量。
体外mTORC1激酶活性测定
评估Rag缺失是否影响mTORC1内在激酶活性。
从WT或RagA/B KO HEK293FT免疫纯化内源mTORC1，以重组His6-4E-BP1为底物进行体外激酶反应。
不同氨基酸组与外源信号感知
测试非溶酶体mTORC1是否响应特定外源氨基酸及生长因子。
在WT与RagA/B KO细胞中缺失–MLIGV、–HRK、–STC或单个丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸1 h，并检测S6K磷酸化；同时检测胰岛素、Akt抑制剂、葡萄糖饥饿等刺激。
下游细胞功能验证
确定两类mTORC1实体调控的不同生理过程。
用OPP掺入检测新生蛋白合成，TFEB/TFE3定位评分、LysoTracker染色、LC3B免疫荧光和RNA-seq分析转录程序。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 高糖Dulbecco改良Eagle培养基 | Gibco | 41965039 |
| 胎牛血清 | Sigma | F7524 | |
| 胎牛血清 | Biowest | S1810 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX培养基 | Gibco | 31331093 | |
| 药物处理 | 巴弗洛霉素A1 | Enzo | BML-CM110-0100 |
| 康卡霉素A | Sigma | C9705 | |
| 氯喹 | Sigma | C6628 | |
| E64 | Roth | 2935.1 | |
| 胃蛋白酶抑制剂A | Roth | 2936.1 | |
| Torin1 | Cell Signaling Technology | 14379 | |
| 雷帕霉素 | Selleckchem | S1039 | |
| Akt抑制剂VIII | Enzo | ENZ-CHM125 | |
| Golgicide A | Sigma | 345862 | |
| 布雷菲德菌素A | Bio-Rad | BUF075 | |
| 二甲基亚砜 | Roth | 4720.1 | |
| 生长因子刺激 | 胰岛素 | Sigma | I9278 |
| 细胞培养 | 无葡萄糖DMEM | Gibco | 11966025 |
| 透析胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞系构建与筛选 | 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | A11138-03 |
| 质粒转染 | Effectene转染试剂 | Qiagen | 301425 |
| X-tremeGENE HP DNA转染试剂 | Roche | 06366236001 | |
| 基因沉默 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778075 |
| RLuc对照siRNA | Horizon Discoveries | P-002070-01-50 | |
| 细胞裂解 | PhosSTOP磷酸酶抑制剂 | Roche | 04906837001 |
| cOmplete蛋白酶抑制剂 | Roche | 11836153001 | |
| 蛋白定量 | 蛋白测定染料试剂 | Bio-Rad | 5000006 |
| 蛋白浓缩 | 3 kDa截留浓缩管 | VWR | 516-0227 P |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | Amersham | 10600002 |
| PVDF膜 | Amersham | 10600023 | |
| 脱脂奶粉 | Serva | 42590 | |
| Tween-20 | AppliChem | A1389 | |
| 牛血清白蛋白 | Roche | 10735086001 | |
| ECL免疫印迹底物 | Promega | W1015 | |
| SuperSignal West Pico PLUS | Thermo Scientific | 34577 | |
| SuperSignal West Femto底物 | Thermo Scientific | 34095 | |
| λ-磷酸酶处理 | λ-磷酸酶 | New England Biolabs | P0753 |
| 溶酶体免疫沉淀 | Pierce抗HA磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88837 |
| DynaMag磁力架 | Invitrogen | 12320D | |
| 重组蛋白纯化 | Ni-NTA琼脂糖 | Qiagen | 1018244 |
| 咪唑 | Applichem | A1073 | |
| 体外激酶实验 | 抗mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2983 |
| Protein A琼脂糖珠悬液 | Roche | 11134515001 | |
| 免疫荧光 | 纤连蛋白 | Applichem | A8350 |
| 明胶 | Sigma | G1393 | |
| 抗mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2983 | |
| 抗RagC抗体 | Cell Signaling Technology | 9480 | |
| 抗LAMP2抗体H4B4 | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4B4 | |
| 抗LAMP2抗体ABL-93 | Developmental Studies Hybridoma Bank | ABL-93 | |
| 抗GM130抗体 | BD Transduction Laboratories | 610822 | |
| 抗TFEB抗体 | Cell Signaling Technology | 4240 | |
| 抗TFE3抗体 | Cell Signaling Technology | 14779 | |
| DAPI | VWR | A1001 | |
| Fluoromount-G封片剂 | Invitrogen | 00-4958-02 | |
| Triton X-100 | AppliChem | A4975 | |
| 抗LC3B抗体 | Cell Signaling Technology | 3868 | |
| 抗p62抗体 | MBL | PM045 | |
| 溶酶体染色 | LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 |
| 免疫电镜 | 驴血清 | Abcam | ab7475 |
| BSA-c | Aurion | 900.022 | |
| OPP实验 | Click-iT Plus OPP蛋白合成检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10456 |
| RNA提取 | TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 |
| cDNA合成 | RevertAid H Minus逆转录酶试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | EP0451 |
| RT-qPCR | Maxima SYBR Green/ROX qPCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | K0223 |
| 单细胞克隆 | 克隆环 | Sigma-Aldrich | CLS31668 |
| 细胞裂解 | cOmplete蛋白酶抑制剂（无EDTA） | Roche | 11873580001 |
| 溶酶体免疫沉淀 | cOmplete蛋白酶抑制剂 | Roche | 11697498001 |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂 | Roche | 04906837001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 溶酶体功能抑制处理 | BafA1（100 nM，6 h）、ConA（100 nM，6 h）、CQ（50 μM，6 h）、PepA 50 μM+E64 25 μM（16 h）的剂量与处理时长；抑制剂需同时加入处理培养基 阅读提示：Methods“Cell culture treatments”及图1、图2、Extended Data Fig. 2图注 |
| 氨基酸饥饿与add-back | 基础（+AA）替换处理培养基60–90 min；饥饿（−AA）1 h；add-back 10或30 min；使用10%透析FBS 阅读提示：Methods“Cell culture treatments”及图1–3图注 |
| 特定氨基酸组缺失 | –MLIGV、–HRK、–STC及单个丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸缺失处理1 h；RagA/B KO与WT对照 阅读提示：图7及Extended Data Fig. 7、8图注与Results相应段落 |
| Rag与LAMTOR1遗传操作 | RagA/B、RagC/D KO克隆验证；LAMTOR1 siRNA 20 nM、72 h敲低效率；GNPTAB敲低或KO 阅读提示：Methods“Generation of KO cell lines”“Gene silencing experiments”及图3、图5、Extended Data Fig. 6 |
| mTORC1活性与定位检测 | 共定位定量每条件约50个细胞、3–5个独立视野，阈值方法（Manders或Pearson）；Torin1 250 nM 1 h、rapamycin 20 nM作为抑制对照 阅读提示：Methods“Quantification of colocalization”“Statistics and reproducibility”及各图图注 |
| lyso-IP与免疫电镜 | HA-TMEM192与FLAG-TMEM192对照；免疫电镜每条件58–60个随机区域、来自三张独立切片；金颗粒标记比例 阅读提示：Methods“Lysosome purification (lyso-IP) assays”“Immunoelectron microscopy”及图5图注 |