高通量筛选鉴定cGAS–染色质定位调控通路
寻找调控cGAS与染色质相互作用的分子通路。
在HCT116细胞中建立GFP2-cGAS与Rluc8-H2A的eBRET2生物传感器，对8,326种化合物文库进行高通量筛选，并用免疫荧光和染色质分级验证PI3K–mTOR通路作用。
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mTORC2驱动的染色质cGAS通过表观遗传重编程介导结直肠癌的化疗耐药
mTORC2-driven chromatin cGAS mediates chemoresistance through epigenetic reprogramming in colorectal cancer.
实验完整度
高含体外细胞、小鼠异位移植瘤、PDX及AOM/DSS模型，并完成磷酸化位点、CUT&Tag、ChIP和功能回补验证
主要模型
HCT116结直肠癌细胞系 BALB/c nude小鼠皮下异位移植瘤模型 RICTOR+/+和RICTOR−/−结直肠癌PDX模型 AOM/DSS诱导的cGAS-KO小鼠结肠炎相关结直肠癌模型
重点核对
cGAS S37A/S37D及S213D突变体在cGAS敲低/敲除HCT116细胞中的回补实验 RICTOR敲除或敲低及JR-AB2-011处理对cGAS Ser37磷酸化和染色质定位的影响 5-FU浓度梯度处理24 h后的细胞活力及 colony formation 实验 小鼠异位移植瘤中5-FU 23 mg/kg每周两次腹腔注射连续5周 PDX和AOM/DSS模型中5-FU 23 mg/kg与BPTES 30 mg/kg每周两次联合给药5周
摘要
环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cGAS）是一种胞质DNA感受器，启动STING依赖的先天免疫反应，其紧密结合染色质并被抑制催化活性；然而，cGAS被招募至染色质的机制及染色质结合cGAS（ccGAS）的功能尚不清楚。本研究发现，mTORC2介导的人cGAS丝氨酸37磷酸化促进其在结直肠癌细胞中的染色质定位，以STING非依赖方式调控细胞生长和耐药。本研究发现ccGAS在特定染色质区域招募SWI/SNF复合物，改变与谷氨酰胺分解和DNA复制相关基因的表达。尽管ccGAS缺失抑制细胞生长，但在体外和体内诱导对氟尿嘧啶的化疗耐药。此外，阻断ccGAS下游靶点肾型谷氨酰胺酶可克服ccGAS缺失引起的化疗耐药。因此，ccGAS通过表观遗传模式协调结直肠癌的可塑性和获得性化疗耐药。靶向mTORC2–ccGAS和谷氨酰胺酶是消除静息耐药癌细胞的一种有前景的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- cGAS如何被招募至染色质，染色质结合的ccGAS在结直肠癌中发挥何种功能，以及其与化疗耐药的关系。
- 核心机制
- mTORC2直接磷酸化cGAS丝氨酸37，促进ccGAS在特定染色质区域招募SWI/SNF复合物，调控DNA复制和谷氨酰胺分解相关基因（包括负调控KGA）的表达，从而协调结直肠癌可塑性和获得性化疗耐药。
- 主要证据
- 体外激酶实验和质谱鉴定Ser37为mTORC2磷酸化位点；S37D/S37A突变体结合染色质及回补实验；CUT&Tag和ChIP显示ccGAS结合KGA启动子；cGAS敲低后TMT蛋白质组学显示DNA复制蛋白下调和KGA上调；细胞活力、异位移植瘤、PDX和AOM/DSS模型显示ccGAS缺失诱导5-FU耐药，BPTES可逆转。
- 研究意义
- 揭示mTOR抑制介导化疗耐药的机制，提示靶向mTORC2–ccGAS–KGA轴可能改善结直肠癌治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定mTORC2而非mTORC1调控cGAS染色质定位
区分mTORC1和mTORC2在cGAS–染色质定位中的作用。
用shRNA敲低RAPTOR或RICTOR，结合免疫荧光、eBRET2和染色质分级检测cGAS–染色质结合。
鉴定mTORC2对cGAS丝氨酸37的磷酸化
验证mTORC2是否直接磷酸化cGAS并确定位点。
体外激酶实验结合LC–MS/MS鉴定磷酸化位点；在RICTOR敲除细胞中检测p-Ser37-cGAS水平及RICTOR回补；用S37D/S37A突变体评估染色质定位。
解析ccGAS染色质结合图谱及互作蛋白
明确ccGAS在基因组上的结合区域及招募的染色质重塑复合物。
CUT&Tag检测cGAS染色质结合位点；免疫共沉淀结合LC–MS/MS鉴定ccGAS互作蛋白；Co-IP验证SWI/SNF组分结合。
验证ccGAS对下游基因表达的调控
确定ccGAS调控的靶基因及其与SWI/SNF的关系。
TMT定量蛋白质组学比较cGAS敲低细胞；ChIP–qPCR检测cGAS和ARID1A在KGA启动子的占据；qPCR和免疫印迹检测KGA及DNA复制相关基因表达。
评估ccGAS缺失对细胞生长和化疗敏感性的影响
验证ccGAS在细胞增殖、细胞周期和5-FU耐药中的作用。
细胞周期FACS分析、平板克隆形成、细胞计数和CCK-8/alamarBlue细胞活力检测，比较cGAS敲低及S37D/S37A/S213D回补条件下对5-FU的敏感性。
体内验证ccGAS对肿瘤生长和5-FU应答的作用
在动物模型中验证ccGAS缺失是否抑制肿瘤生长并诱导化疗耐药。
HCT116细胞皮下接种裸鼠，观察肿瘤形成、体积和重量；肿瘤直径达5 mm后腹腔注射5-FU，比较cGAS敲低及S37D/S37A回补组的治疗反应。
在PDX和AOM/DSS模型中验证KGA抑制逆转耐药
验证抑制KGA能否克服mTORC2–ccGAS轴破坏引起的5-FU耐药。
建立RICTOR−/−和RICTOR+/+ PDX模型，以及cGAS-KO小鼠AOM/DSS结肠炎相关结直肠癌模型，给予5-FU单药或联合BPTES，评估肿瘤生长和负荷。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 化合物处理 | GDC-0941 | Selleck | S1065 |
| BEZ-235 | Selleck | S1009 | |
| MK-2206 | Selleck | S1078 | |
| 雷帕霉素 | Selleck | S1039 | |
| KU-0063794 | Selleck | S1226 | |
| PF-4708671 | Selleck | S2163 | |
| JR-AB2-011 | Selleck | E1151 | |
| 细胞周期同步 | 诺考达唑 | Selleck | S2775 |
| 化疗处理 | 5-氟尿嘧啶 | Selleck | S1209 |
| STING激活 | 2′,3′-cGAMP | Selleck | S7904 |
| KGA抑制 | BPTES | Selleck | S7753 |
| 高通量筛选 | 生物活性化合物库 | Selleck | L1700 |
| AOM/DSS模型 | 氧化偶氮甲烷 | Sigma | A5486 |
| STING激活 | ADU-S100 | MedChemExpress | HY-12885 |
| 免疫印迹 | 抗cGAS抗体（D1D3G） | CST | 15102 |
| 抗KGA抗体 | Proteintech | 20170-1-AP | |
| 抗GAC抗体 | Invitrogen | PA5-40134 | |
| 免疫沉淀 | 抗HA琼脂糖 | Sigma | A2095 |
| 抗FLAG M2磁珠 | Sigma | M8823 | |
| 染色质分级 | 染色质提取试剂盒 | Abcam | ab117152 |
| 蛋白分级 | ProteoExtract蛋白提取试剂盒 | Millipore | 539790 |
| ChIP–qPCR | EZ-Magna ChIP G试剂盒 | Sigma-Aldrich | 17-409 |
| CUT&Tag | CUTANA pAG-Tn5转座酶 | Epicycpher | 15-1117 |
| 刀豆蛋白A磁珠（BioMag Plus） | -- | 86057 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8细胞活力检测试剂盒 | Dojindo | -- |
| alamarBlue细胞活力检测试剂 | Invitrogen | -- | |
| 谷氨酰胺酶活性检测 | GLS检测试剂盒 | Biomedical Research Service | -- |
| PDX建立 | 基质胶 | Corning | 354234 |
| AOM/DSS模型 | 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | 0216011010 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| eBRET2高通量筛选 | 化合物终浓度约10 µM，处理6 h；每孔5×10^4细胞；DeepBlueC终浓度5 µM 阅读提示：Methods“High-throughput screening based on eBRET2 technique”及Fig. 1b,c图注 |
| mTORC2磷酸化cGAS体外实验 | 重组Flag–cGAS 4 µg，ATP 200 µM，30 °C 1 h；RICTOR免疫沉淀来源的mTORC2 阅读提示：Methods“In vitro phosphorylation assays”及Fig. 2e图注 |
| cGAS突变体回补及5-FU敏感性 | cGAS shRNA稳定敲低HCT116细胞；S37D、S37A、S213D突变体；5-FU浓度梯度处理24 h 阅读提示：Methods“Cell viability measurements”及Fig. 4f–h图注 |
| 裸鼠异位移植瘤及5-FU治疗 | 每只皮下注射2×10^6细胞；肿瘤直径达5 mm后5-FU 23 mg/kg每周两次腹腔注射连续5周；每组5–8只 阅读提示：Methods“Tumour growth assay”及Fig. 5d–g、Fig. 6a图注 |
| PDX和AOM/DSS模型联合BPTES | 5-FU 23 mg/kg和BPTES 30 mg/kg每周两次连续5周；AOM 10 mg/kg；DSS浓度2.5%或5% 阅读提示：Methods“PDX establishment”和“Mouse models of colitis-associated colorectal cancer”及Fig. 6g、Fig. 7b–d图注 |