PPIA在HSPC中的丰度与功能缺失表型分析
确定PPIA在造血干/祖细胞中的表达丰度及其缺失对造血干细胞功能的影响。
通过2D凝胶电泳和质谱分析小鼠HSPC蛋白质组；进行竞争性骨髓移植和连续移植，流式细胞术分析外周血和骨髓嵌合、髓系/淋系比例、HSPC和CD150high HSC比例及长期再增殖能力。
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亲环素A支持内在无序蛋白的翻译并影响造血干细胞衰老
Cyclophilin A supports translation of intrinsically disordered proteins and affects haematopoietic stem cell ageing.
实验完整度
高包含体外细胞系、原代小鼠HSPC、骨髓移植模型、衰老小鼠及多组学验证，并有功能与机制验证
主要模型
小鼠造血干/祖细胞（HSPC） Ppia敲除与杂合小鼠骨髓移植模型 HeLa与293T细胞系 OCI-AML3细胞系
重点核对
竞争性骨髓移植：CD45.2+ Ppia−/−或Ppia+/−供体细胞与等量CD45.1+野生型支持细胞共移植，每组n=10起始 PPIA底物鉴定：比较野生型PPIA与G104A突变体共免疫沉淀，底物定义为野生型PSM丰度至少高1.5倍 PPIA敲低效率：Kd1和Kd2构建体经免疫印迹验证>80%敲低效率 应激颗粒诱导：sodium arsenite 50 μM处理1小时，G3BP1免疫染色定量 衰老比较：年轻（4-6月或5月）与年老（23月、28月或31-33月）小鼠HSPC的蛋白质组与转录组比较
摘要
蛋白质功能丧失是衰老的驱动力。我们在造血干/祖细胞中鉴定出肽基脯氨酰异构酶A（PPIA或亲环素A）是一种占主导地位的分子伴侣。PPIA的缺失会加速干细胞衰老。我们发现具有内在无序区（IDR）的蛋白质是PPIA的常见底物。IDR促进与其他蛋白质或核酸的相互作用，并可触发液-液相分离。超过20%的PPIA底物参与超分子无膜细胞器的形成。PPIA影响应激颗粒（PABPC1）、P小体（DDX6）和核仁（NPM1）的调控因子，以促进相分离并增加细胞应激抗性。造血干细胞衰老与PPIA表达的转录后下降以及富含IDR的蛋白质翻译减少有关。在此，我们将分子伴侣PPIA与内在无序蛋白的合成联系起来，这表明受损的蛋白质相互作用网络和大分子凝聚可能是造血干细胞衰老的潜在决定因素。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PPIA如何影响造血干/祖细胞的蛋白质组，以及其缺失是否与造血干细胞衰老相关？
- 核心机制
- PPIA作为分子伴侣在翻译早期促进其底物（富含IDR的蛋白质）的脯氨酸异构化，支持这些蛋白质的合成和相分离能力；PPIA表达随衰老转录后下降，导致IDR丰富蛋白翻译减少和蛋白质组结构多样性降低。
- 主要证据
- 竞争性骨髓移植显示Ppia−/−细胞出现髓系偏斜、免疫表型干细胞增加但功能下降及自我更新受损；共免疫沉淀-质谱鉴定约400个PPIA底物且富含IDR；脉冲SILAC和OPP掺入实验显示PPIA缺失降低底物翻译；PPIA敲低减少应激颗粒、P小体和核仁形成；衰老HSC中PPIA蛋白下降且IDR丰富蛋白减少。
- 研究意义
- 将分子伴侣PPIA与内在无序蛋白合成联系起来，提示受损的蛋白质相互作用网络和大分子凝聚可能是造血干细胞衰老的潜在决定因素，且合成无序蛋白的能力可能是细胞健康的一个此前未被认识的决定因素，不能通过基于转录本的方法捕获。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PPIA过表达对年老HSPC移植功能的挽救
验证PPIA表达水平与造血干细胞衰老表型之间的因果关系。
将18月龄小鼠lin−/Sca1+/c-Kit+细胞用表达Ppia或对照（反向互补）的慢病毒转导，移植入致死照射受体，随访6个月分析外周血嵌合和髓系偏斜。
PPIA底物鉴定与IDR富集分析
鉴定PPIA的直接底物蛋白并分析其结构特征。
在293T细胞中转染3XF-WT PPIA或3XF-G104A突变体PPIA，进行共免疫沉淀和质谱鉴定差异结合蛋白；用IUPred2A预测IDR含量并与总蛋白质组比较；用IP-免疫印迹验证内源性PPIA与PABPC1、DDX6、NPM1、G3BP1的相互作用。
PPIA对底物蛋白质翻译的影响
验证PPIA是否在翻译水平促进其底物的合成。
在HeLa和293T细胞中进行脉冲SILAC实验，比较对照和PPIA敲低细胞中新合成蛋白质的重/轻同位素比值；用荧光嘌呤霉素类似物（OPP）标记原代HSPC，检测PPIA抑制剂TMN355处理后的翻译速率。
PPIA对相分离和无膜细胞器形成的影响
验证PPIA是否影响其底物的液-液相分离及无膜细胞器形成。
在HeLa细胞中敲低PPIA，用sodium arsenite诱导应激颗粒，免疫染色G3BP1定量应激颗粒；免疫染色DDX6定量P小体；在NPM1-mCherry敲入OCI-AML3细胞中定量核仁大小和形态；用PLA在原代HSC中验证PPIA与PABPC1、DDX6、NPM1的相互作用。
衰老过程中PPIA和IDR丰富蛋白的变化
验证PPIA表达和IDR丰富蛋白水平是否随造血干细胞衰老而下降。
用PLA定量年轻（5月龄）和年老（23月龄）小鼠HSC中PPIA蛋白水平；用TMT MS/MS和RNA-seq比较年轻与年老及Ppia+/−与Ppia−/−小鼠HSPC蛋白质组和转录组中IDR含量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 二维凝胶电泳 | Zoom IPGRunner系统 | Invitrogen | -- |
| CyDyes DIGE荧光染料 | Amersham | -- | |
| Typhoon FLA 9000扫描仪 | GE Healthcare | -- | |
| 质谱分析 | LTQ线性离子阱质谱仪 | Thermo | -- |
| LTQ Orbitrap Elite质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| Orbitrap Fusion三合一质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 纳升高效液相色谱1000系统 | Thermo Scientific | -- | |
| UltiMate 3000二元纳升液相色谱系统 | Dionex | -- | |
| 细胞培养与处理 | TMN355 | Selleckchem | -- |
| MG132 | -- | -- | |
| 免疫沉淀与免疫印迹 | 抗FLAG抗体（M2克隆） | Millipore Sigma | -- |
| 抗PPIA抗体（ab58144） | Abcam | ab58144 | |
| 抗PABPC1抗体（4992） | Cell Signaling Technology | 4992 | |
| 抗DDX6抗体（14632-1-AP） | Proteintech | 14632-1-AP | |
| 抗NPM1抗体（10306-1-AP） | Proteintech | 10306-1-AP | |
| 抗G3BP1抗体（13057-2-AP） | Proteintech | 13057-2-AP | |
| 邻近连接 assay | Duolink原位红色起始试剂盒（小鼠/兔）（DUO92101） | Millipore Sigma | DUO92101 |
| RNA测序 | TruSeq链特异性总RNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| SMARTer链特异性总RNA测序试剂盒v.2（634418） | Takara Bio | 634418 | |
| HiSeq2500测序仪 | Illumina | -- | |
| NovaSeq 6000系统 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 竞争性骨髓移植 | 供体细胞类型与数量（CD45.2+总骨髓细胞375,000）、竞争细胞数量（等量CD45.1+）、致死照射剂量（9.5 Gy）、每组起始n=10、分析时间点（移植后6个月和7个月） 阅读提示：Methods 'Transplantations'和'PB and BM cell analysis'小节；Fig. 1c,d,e,f图注 |
| 连续移植 | 每轮供体细胞数（500,000）、竞争细胞数（500,000）、二次移植时间（首次移植后2个月）、第三次移植时间（二次后2个月）、最终评估时间（第三次移植后7个月）、每组n=5（第一轮）和n=8（第二和第三轮） 阅读提示：Methods 'Serial transplantations'小节；Fig. 1g,h图注 |
| PPIA底物鉴定 | PPIA突变体（G104A）选择依据、转染时间（48小时）、免疫沉淀抗体（抗FLAG M2克隆，4 μl，1 μg/μl）、底物判定阈值（野生型PSM至少1.5倍于突变体）、质谱平台（LTQ Orbitrap Elite和Q Exactive Plus） 阅读提示：Methods 'Immunoprecipitations and western blots'和'MS/MS'小节；Fig. 3a,c图注 |
| 脉冲SILAC | 标记时间（24小时）、重同位素氨基酸浓度（0.46 mM赖氨酸-2HCl，0.47 mM精氨酸-HCl）、细胞类型（HeLa和293T）、PPIA敲低构建体（Kd1/Kd2，>80%敲低效率）、嘌呤霉素筛选浓度（2 μg/ml） 阅读提示：Methods 'Pulsed SILAC'和'Cell culture and drug treatments'小节；Fig. 4a,b,c图注 |
| 应激颗粒和P小体形成 | sodium arsenite浓度（50 μM）和处理时间（1小时）、PPIA敲低细胞系（HeLa Kd1）、TMN355浓度（10 μM）和处理时间（24-48小时）、G3BP1和DDX6抗体货号、成像设备（Celldiscoverer 7） 阅读提示：Methods 'Cell culture and drug treatments'小节；Fig. 5a,b图注 |
| 衰老比较蛋白质组与转录组 | 小鼠年龄（年轻4-6月或5月，年老23月、28月或31-33月）、HSPC分离方法（EasySep试剂盒）、TMT标记试剂（TMTsixplex）、RNA-seq平台（HiSeq2500或NovaSeq 6000）、每组n=3（Ppia+/− vs Ppia−/−）或n=2（年轻 vs 年老） 阅读提示：Methods 'Tandem-mass-tag isobaric labelling'和'RNA sequencing'小节；Fig. 6b,c图注；Extended Data Fig. 4b,c,d |