酵母中TORC1通路与脂肪酸合成机制的遗传药理学互作分析
探究TORC1信号与核心脂肪酸合成机器之间是否存在功能互作。
使用cerulenin抑制FAS，测试TORC1通路突变体（gtr1Δ、gtr1S20L、gtr1Q65L等）的敏感性；重新分析SATAY转座子数据。
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丙二酰辅酶A是一种保守的内源性ATP竞争性mTORC1抑制剂
Malonyl-CoA is a conserved endogenous ATP-competitive mTORC1 inhibitor.
实验完整度
高包含酵母和哺乳动物细胞模型、体外激酶实验、分子动力学模拟、基因敲除和敲低等多层级功能与机制验证。
主要模型
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 人胚肾HEK293FT细胞 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs） 人乳腺癌MCF-7细胞
重点核对
酿酒酵母中cerulenin处理（20 μM）和Acc1S1157A表达对TORC1活性（p-Sch9T737）的影响 HEK293FT细胞中Fasnall（25 μM）、cerulenin（50 μM）或siFASN处理对mTORC1活性（p-S6KT389、p-4E-BP1T37/46）的影响 体外激酶实验中Mal-CoA、乙酰辅酶A和辅酶A对纯化TORC1/mTORC1的剂量依赖性抑制及IC50测定 ATP竞争实验中增加ATP浓度对Mal-CoA抑制效果的影响及Ki值计算 分子动力学模拟中Mal-CoA与mTOR催化口袋的结合稳定性及关键残基R2168/R2170的作用
摘要
细胞生长受哺乳动物/机制性雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）调控，mTORC1既作为营养传感器，又作为几乎所有生物合成途径的主控制器。这确保细胞仅在生长条件最佳时才具有代谢活性。值得注意的是，尽管已知mTORC1调控脂肪酸生物合成，但细胞脂质生物合成能力如何以及是否反馈以微调mTORC1活性仍知之甚少。在此我们表明，mTORC1通过检测丙二酰辅酶A（该生物合成途径的中间体）的水平来感知细胞合成脂肪酸的能力。我们发现，在酵母和哺乳动物细胞中，这种调控是直接的，丙二酰辅酶A结合mTOR催化口袋并作为特异性ATP竞争性抑制剂发挥作用。当脂肪酸合酶（FASN）被下调/抑制时，升高的丙二酰辅酶A水平被引导至与乙酰辅酶A羧化酶1（ACC1）和FASN形成直接蛋白质-蛋白质相互作用的近端mTOR分子。我们的发现代表了一种保守且独特的稳态机制，即脂肪酸生成受损导致mTORC1活性降低，从而将该代谢途径与整体细胞生物合成输出协调联系起来。此外，它们揭示了在哺乳动物细胞中存在一种通过竞争ATP结合直接抑制信号激酶活性的生理代谢物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞脂肪酸生物合成能力如何以及是否反馈调节mTORC1活性？
- 核心机制
- 丙二酰辅酶A直接结合mTOR催化口袋，作为ATP竞争性抑制剂抑制mTORC1活性；FASN抑制或ACC1过度激活导致丙二酰辅酶A积累，进而抑制与ACC1/FASN形成蛋白相互作用的近端mTORC1。
- 主要证据
- 在酵母和哺乳动物细胞中，FASN/Fas1抑制或ACC1激活降低mTORC1/TORC1活性；体外激酶实验显示Mal-CoA剂量依赖性抑制mTORC1（IC50=230 μM，Ki=770 μM），且为ATP竞争性；分子动力学模拟和MST证实Mal-CoA结合mTOR催化口袋。
- 研究意义
- 揭示了一种保守的稳态机制，将脂肪酸生物合成能力与mTORC1活性直接连接，为理解代谢信号协调及靶向mTORC1/FASN的治疗策略提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
酵母中Mal-CoA水平变化对TORC1活性的影响
验证Mal-CoA水平升高是否抑制TORC1活性。
使用GFP报告系统检测Mal-CoA水平；通过cerulenin处理或Acc1S1157A表达升高Mal-CoA；检测Sch9T737磷酸化。
哺乳动物细胞中FASN抑制对mTORC1活性的影响
验证FASN抑制是否通过Mal-CoA积累抑制mTORC1。
在HEK293FT等细胞中使用Fasnall、cerulenin或siFASN抑制FASN；检测S6K、4E-BP1磷酸化及Mal-K水平；检测新生蛋白合成。
验证Mal-CoA抑制mTORC1独立于脂肪酸可用性和上游调控因子
区分Mal-CoA积累与棕榈酸减少的作用，并检验Rag GTPase、TSC、AMPK等上游因子的参与。
使用charcoal-stripped FBS或BSA偶联脂肪酸补充；在RagA/B、RagC/D、TSC1、AMPKα1/2敲除细胞中测试FASN抑制效果。
验证mTORC1与FASN/ACC1的蛋白质相互作用
探究FASN和ACC1是否与mTORC1直接相互作用。
在酵母和哺乳动物细胞中进行免疫共沉淀、链霉亲和素 pulldown、MST结合实验；免疫荧光和PLA检测FASN与溶酶体共定位；DexoMAG溶酶体分离。
分子动力学模拟和对接分析Mal-CoA与mTOR催化口袋的结合
在原子水平预测Mal-CoA、乙酰辅酶A和辅酶A与mTOR的结合模式。
基于mTOR-ATPγS晶体结构（PDB 4JSP）进行对接和全原子分子动力学模拟；计算结合自由能；进行计算机突变。
体外激酶实验验证Mal-CoA对mTORC1的直接抑制和ATP竞争性
实验验证Mal-CoA是否直接结合并抑制mTORC1，且为ATP竞争性。
使用纯化酵母TORC1或免疫沉淀哺乳动物mTORC1进行体外激酶实验；加入递增浓度的Mal-CoA、乙酰辅酶A或辅酶A；进行ATP竞争实验；MST检测Mal-CoA与TORC1结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 酵母培养 | 酵母氮源基础 | CONDA | 1545 |
| 硫酸铵 | MP Biomedicals | 4808211 | |
| 葡萄糖 | AppliChem | 1422 | |
| 氨基酸缺陷型培养基（缺组氨酸） | US Biological | D9520 | |
| 组氨酸 | AppliChem | A1341 | |
| 酵母培养处理 | 谷氨酰胺 | Acros | 119951000 |
| 浅蓝菌素 | Sigma-Aldrich | C2389 | |
| 哺乳动物细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | Gibco | 41965-039 |
| 胎牛血清 | Sigma; Biowest | F7524; S1810 | |
| 非必需氨基酸 | Gibco | 11140-035 | |
| DMEM/F12 GlutaMAX培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31331093 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 哺乳动物细胞处理 | Fasnall | Sigma-Aldrich | SML1815 |
| 浅蓝菌素 | Sigma-Aldrich | C2389 | |
| U0126 | Cell Signaling Technology | 9903 | |
| 雷帕霉素 | Selleckchem | S1039 | |
| 二甲基亚砜 | Roth | 4720.1 | |
| 活性炭处理胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | A3382101 | |
| 无脂肪酸牛血清白蛋白（V组分） | Roche | 10735086001 | |
| 丙二酰辅酶A锂盐 | Sigma-Aldrich | M4263 | |
| 分子克隆 | Effectene转染试剂 | Qiagen | 301425 |
| X-tremeGENE HP转染试剂 | Sigma-Aldrich | 6366236001 | |
| 基因敲除 | 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | A11138-03 |
| 基因沉默 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778075 |
| 蛋白免疫印迹 | PhosSTOP磷酸酶抑制剂 | Roche | 4906837001 |
| cOmplete蛋白酶抑制剂 | Roche | 11836153001 | |
| 免疫共沉淀 | 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11697498001 |
| 抗HA磁珠 | Pierce | 88837 | |
| 无EDTA cOmplete蛋白酶抑制剂 | Roche | 11873580001 | |
| Protein A琼脂糖珠浆 | Roche | 11134515001 | |
| 链霉亲和素拉下实验 | 链霉亲和素琼脂糖 | Cytiva | 90100484 |
| MST实验 | 丙二酰辅酶A | Sigma-Aldrich | M4263 |
| OPP掺入实验 | OPP试剂 | Jena Bioscience | NU-931-05 |
| Click-iT plus OPP蛋白质合成检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | C10456 | |
| 酵母TORC1激酶实验 | 丙二酰辅酶A | Sigma-Aldrich | M4263 |
| 乙酰辅酶A | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| 辅酶A | Sigma-Aldrich | C3144 | |
| [γ-32P]ATP | Hartmann Analytic | SRP-501 | |
| SYPRO Ruby蛋白染色剂 | Sigma-Aldrich | S4942 | |
| 哺乳动物mTORC1激酶实验 | 丙二酰辅酶A | Sigma-Aldrich | M4263 |
| 乙酰辅酶A | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| 辅酶A | Sigma-Aldrich | C3144 | |
| 抗磷酸化4E-BP1T37/46抗体 | Cell Signaling Technology | 9459 | |
| 免疫荧光 | 抗mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2983 |
| 抗RagC抗体 | Cell Signaling Technology | 9480 | |
| 抗LAMP2抗体（H4B4） | Developmental Studies Hybridoma Bank | -- | |
| DAPI | VWR | A1001 | |
| Fluoromount-G封片剂 | Invitrogen | 00-4958-02 | |
| PLA实验 | Duolink原位红色起始试剂盒（鼠/兔） | Sigma-Aldrich | DUO92101 |
| 抗FASN抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-22061 | |
| 抗LAMP2抗体（H4B4） | Developmental Studies Hybridoma Bank | -- | |
| DexoMAG溶酶体分离 | DexoMAG 40 | Liquids Research Ltd | -- |
| LS柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 蔗糖 | Applichem | A2211 | |
| 脂质组学 | 氘代EquiSplash脂质组学混合物 | Avanti | -- |
| U-13C15N氨基酸混合物 | Cambridge isotopes | MSK_A2-1.2 | |
| 13C10 ATP | Sigma | -- | |
| 15N5 ADP | Sigma | -- | |
| 13C1015N5 AMP | Sigma | -- | |
| 氘代柠檬酸 | Sigma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 酵母中FAS抑制与TORC1活性检测 | cerulenin浓度（20 μM）、处理时间、培养基和温度（30 °C） 阅读提示：Methods 'Yeast culture treatments'及图2a-c图注 |
| 哺乳动物细胞中FASN抑制或敲低 | Fasnall浓度（25 μM）和处理时间（30分钟）、cerulenin浓度（50 μM）和处理时间（4小时）、siRNA浓度（20 nM）和转染试剂 阅读提示：Methods 'Mammalian cell culture treatments'和'Gene silencing experiments'及图2f-k图注 |
| 体外激酶实验检测Mal-CoA对mTORC1的抑制 | 纯化TORC1/mTORC1用量、底物（Lst4Loop、4E-BP1）量、ATP浓度（500 μM）、Mal-CoA浓度范围及反应时间（30分钟，30 °C） 阅读提示：Methods 'Yeast TORC1 kinase activity assays'和'Mammalian mTORC1 kinase activity assays'及图8图注 |
| ATP竞争实验 | ATP浓度梯度设置、Mal-CoA固定浓度（2 mM）、Ki计算模型 阅读提示：图8g-j及相应图注和Methods 'Kinase activity assays' |
| 分子动力学模拟 | 模拟时长（400 ns）、重复次数（3次）、力场（CHARMM-36）、软件（GROMACS 2020）及起始结构（PDB 4JSP） 阅读提示：Methods 'Molecular dynamics simulations' |