SARS-CoV-2感染引起DNA损伤和异常DDR激活
验证SARS-CoV-2感染是否导致DNA损伤和DDR激活
用SARS-CoV-2感染Huh7、Calu-3和HNEpC，通过免疫印迹、免疫荧光和comet assay检测DDR标志物和DNA断裂
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
SARS-CoV-2感染通过CHK1降解和53BP1募集受损诱导DNA损伤及细胞衰老
SARS-CoV-2 infection induces DNA damage, through CHK1 degradation and impaired 53BP1 recruitment, and cellular senescence.
实验完整度
高包含体外细胞系、原代细胞、小鼠模型和患者样本多个独立证据层级，并进行功能验证（dN补充、CHK1敲低）和机制验证（蛋白降解、RIP、NHEJ报告系统）。
主要模型
Huh7细胞系 Calu-3细胞系 人鼻上皮原代细胞（HNEpC） K18-hACE2小鼠模型
重点核对
SARS-CoV-2感染复数（MOI）为0.1（体外细胞）或1（HNEpC），小鼠鼻内接种1×10^5 TCID50 CHK1敲低使用siRNA，dN补充使用5 μM dA/dC/dG（Huh7）或50 μM dA/dC、5 μM dG/dT（Calu-3） 蛋白酶体抑制剂MG132（10 μM, 6 h）和自噬抑制剂BafA1（100 nM）或CQ（50 μM, 6 h）处理 comet assay检测DNA断裂，免疫荧光定量γH2AX、pRPAS4/8、53BP1 foci（至少30细胞/条件） 小鼠感染后6天取材，患者样本包括COVID-19（n=17肺，n=18鼻黏膜FISH+）和非COVID对照
摘要
严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）是导致2019冠状病毒病（COVID-19）大流行的RNA病毒。尽管有报道称SARS-CoV-2可改变多种细胞通路，但其对DNA完整性的影响及涉及机制仍不清楚。本研究表明，SARS-CoV-2引起DNA损伤并引发异常的DNA损伤应答。机制上，SARS-CoV-2蛋白ORF6和NSP13分别通过蛋白酶体和自噬途径导致DNA损伤应答激酶CHK1降解。CHK1缺失导致脱氧核苷三磷酸（dNTP）短缺，引起S期进程受损、DNA损伤、促炎通路激活和细胞衰老。补充脱氧核苷可减少上述现象。此外，SARS-CoV-2 N蛋白通过干扰损伤诱导的长链非编码RNA而损害53BP1的焦点募集，从而减少DNA修复。关键观察结果在SARS-CoV-2感染小鼠和COVID-19患者中得以重现。我们提出，SARS-CoV-2通过提升核糖核苷三磷酸水平以促进自身复制而牺牲dNTPs，并劫持损伤诱导的长链非编码RNA生物学功能，威胁基因组完整性并导致DNA损伤应答激活异常、炎症诱导和细胞衰老。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2感染是否影响基因组完整性，以及其导致DNA损伤和DNA损伤应答异常的机制是什么？
- 核心机制
- SARS-CoV-2 ORF6通过蛋白酶体途径、NSP13通过自噬途径降解CHK1，导致RRM2减少和dNTP短缺，引起S期进程受损和DNA损伤；同时N蛋白竞争性结合损伤诱导长链非编码RNA，损害53BP1募集和NHEJ修复。
- 主要证据
- 在Huh7、Calu-3、HNEpC细胞中，SARS-CoV-2感染引起DNA断裂（comet assay）、DDR标志物升高、CHK1/RRM2降低、dNTP减少和S期积累；dN补充或CHK1敲低实验验证因果关系；小鼠和COVID-19患者肺及鼻黏膜中观察到DNA损伤增加、CHK1/RRM2降低和53BP1募集受损。
- 研究意义
- 揭示了SARS-CoV-2感染对基因组完整性的影响，为理解COVID-19患者中观察到的炎症反应和细胞衰老提供了机制模型。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CHK1-RRM2-dNTP轴介导S期进程受损和DNA损伤
验证CHK1缺失导致RRM2降低、dNTP短缺和S期进程受损
检测感染后CHK1和RRM2蛋白/mRNA水平、dNTP浓度、细胞周期和BrdU掺入；通过siRNA敲低CHK1验证因果性；补充dN验证挽救效应
ORF6和NSP13分别通过蛋白酶体和自噬途径降解CHK1
鉴定导致CHK1降解的病毒蛋白及其降解途径
表达24种SARS-CoV-2蛋白筛选CHK1下调；针对ORF6使用点突变ORF6M58R和MG132；针对NSP13使用BafA1、CQ和BECN1/LC3B siRNA；免疫共沉淀检测CHK1泛素化
N蛋白干扰53BP1募集和NHEJ修复
验证N蛋白是否通过竞争dilncRNA抑制53BP1焦点形成和DNA修复
在感染细胞和表达N蛋白的细胞中检测53BP1 foci；显微注射重组N蛋白进行活细胞成像；RIP检测N蛋白与dilncRNA结合；EJ5-GFP报告系统检测NHEJ效率
体内验证DNA损伤、CHK1/RRM2降低和衰老
在动物模型和患者样本中验证体外发现
K18-hACE2小鼠鼻内接种SARS-CoV-2后6天检测肺组织DDR标志物、CHK1、RRM2和衰老标志物；COVID-19患者肺和鼻黏膜样本进行IHC/IF/FISH
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | ThermoFisher | -- |
| 胎牛血清 | ThermoFisher | -- | |
| 药物处理 | MG132 | Sigma | M7449 |
| 巴弗洛霉素A1 | Selleckchem | S1413 | |
| 氯喹 | Sigma | C6628 | |
| dN补充 | 脱氧腺苷 | Sigma | D8668 |
| 脱氧胞苷 | Sigma | D0776 | |
| 脱氧鸟苷 | Sigma | D0901 | |
| 脱氧胸苷 | Sigma | T1895 | |
| 免疫荧光 | Hoechst 33342三盐酸盐 | Invitrogen | h3570 |
| Mowiol封片剂 | Sigma | 81381 | |
| 免疫印迹 | Bioruptor Next Gen超声破碎仪 | Diagenode | -- |
| RNA提取 | TriFast试剂 | Euroclone | EMR507100 |
| RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- | |
| RT-qPCR | SuperScript VILO cDNA合成试剂盒 | ThermoFisher | -- |
| SYBR Green I Master Mix | Roche | -- | |
| 彗星实验 | 单细胞凝胶电泳彗星实验试剂盒 | Trevigen | 4250-050-K |
| 流式细胞术 | Attune NxT流式细胞仪 | ThermoFisher | -- |
| 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | -- | |
| 质粒转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | ThermoFisher | -- |
| siRNA转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | ThermoFisher | -- |
| 多重免疫分析 | Bio-Plex Pro人细胞因子免疫分析试剂盒 | Bio-Rad | -- |
| Bio-Plex 200系统 | Bio-Rad | -- | |
| 泛素化实验 | Benzonase核酸酶 | Sigma | E1014-25KU |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA琼脂糖珠 | Qiagen | -- |
| HiTrap Heparin HP柱 | Cytiva | -- | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | -- | |
| 显微注射 | UltraVIEW VoX转盘共聚焦系统 | PerkinElmer | -- |
| FemtoJet显微注射泵 | Eppendorf | -- | |
| 罗丹明B葡聚糖 | ThermoFisher | -- | |
| 浊度实验 | NanoVue Plus分光光度计 | Cytiva | -- |
| 免疫沉淀 | 抗N蛋白抗体 | Sino Biological | 40588-T62 |
| 免疫组化 | SignalStainBoost免疫组化检测试剂 | Cell Signaling | #18653; #31926 |
| RNA原位杂交 | RNAscope探针-V-nCoV2019-S | ACD | 848561 |
| HNEpC分离 | Accutase细胞消化液 | Sigma | A6964 |
| Dispase | Corning | 354235 | |
| DNA酶II | Sigma | D8764 | |
| HNEpC培养 | Pneumacult培养基 | Stem Cell Technologies | 5050 |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Sigma | T8787 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SARS-CoV-2体外感染 | 病毒株（ICGEB-FVG_5）、MOI（Huh7/Calu-3为0.1，HNEpC为1）、感染时间（1小时吸附后更换培养基，48或72小时分析） 阅读提示：Methods: SARS-CoV-2 propagation and in vitro infection; Isolation and SARS-CoV-2 infection of HNEpCs |
| dN补充实验 | dN种类和浓度（Huh7：5 μM dA/dC/dG；Calu-3：50 μM dA/dC、5 μM dG/dT）、补充持续时间（48小时或24小时） 阅读提示：Methods: dN supplementation |
| CHK1敲低 | siRNA序列（文中未明确说明，见Supplementary Table 2）、转染试剂和敲低效率验证时间（48或72小时） 阅读提示：Methods: Plasmid and siRNA transfection; Supplementary Table 2 |
| 小鼠感染模型 | 小鼠品系（B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J）、接种剂量（1×10^5 TCID50/只）、接种途径（鼻内）、分析时间（感染后6天） 阅读提示：Methods: Mice and treatments |
| 患者样本分析 | 样本类型和数量（肺：COVID-19 n=17，非COVID n=9；鼻黏膜：FISH+ n=18，FISH- n=11）、伦理批件（0019072/P/GEN/ARCS） 阅读提示：Methods: Patients diagnosed with COVID-19 and subjects negative for COVID-19; Figure 8 legend |