srHC蛋白敲低筛选与基因/重复元件激活分析
鉴定哪些srHC蛋白抑制异染色质基因和重复元件
在人类原代成纤维细胞中对94个srHC蛋白及3个H3K9me3甲基转移酶进行两轮siRNA敲低，以siControl为对照进行RNA-seq，分析srHC基因和重复元件（SalmonTE和RepEnrich）的上调情况
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多种异染色质相关蛋白抑制不同类别的基因和重复元件
Diverse heterochromatin-associated proteins repress distinct classes of genes and repetitive elements.
实验完整度
高包含人类成纤维细胞和HepG2细胞系、siRNA敲低筛选、RNA-seq、ChIP-seq、免疫荧光、Western blot及hiHep重编程功能验证
主要模型
人类BJ包皮成纤维细胞 HepG2细胞系 hiHep重编程细胞
重点核对
两轮siRNA转染（间隔三天）敲低97个srHC蛋白，每个靶标使用两条独立siRNA，各设两个重复 RNA-seq以siControl为对照，DESeq2分析差异表达，Benjamini校正Wald检验p≤0.05且log2(foldchange)>0判定上调 H3K9me3 ChIP-seq以果蝇染色质为spike-in对照，分析15154个H3K9me3结构域的丢失 免疫荧光定量H3K9me3和H3K27me3，每个处理条件成像100–300个细胞 hiHep重编程中FOXA3、HNF1A、HNF4A慢病毒转导，联合siRNA敲低，第14天流式检测ASGPR1阳性率
摘要
异染色质通常以组蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化（H3K9me3）或第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3）为标志，在不同细胞中抑制不同的蛋白编码基因以及重复元件。这种位点特异性的基础尚不清楚。此前，我们鉴定出172个嵌入在含有H3K9me3的超声抗性异染色质（srHC）中的蛋白质。在本研究中，我们在人类细胞中研究了97个H3K9me3-srHC蛋白如何抑制异染色质基因。我们揭示了四组srHC蛋白，每组共同抑制许多基因和重复元件。两组抑制侧翼srHC范围不同的H3K9me3嵌入基因，一组特异性针对同时具有H3K9me3和H3K27me3的srHC基因，另一组特异性针对以srHC为主要特征的基因。我们发现，rudimentary同源物增强子（ERH）在抑制减数分裂基因方面从粟酒裂殖酵母到人类是保守的，并且在人类中现在还抑制其他谱系特异性基因和重复元件。该研究极大地扩展了我们对脊椎动物中基于H3K9me3的基因抑制的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 97个H3K9me3-srHC相关蛋白如何抑制异染色质基因和重复元件，以及这种抑制是否具有位点特异性？
- 核心机制
- 四组srHC蛋白分别抑制具有不同组蛋白修饰和srHC特征的基因及重复元件；ERH通过招募和/或维持HMT SUV39H1在异染色质上，全局维持H3K9me3，从而抑制谱系特异性基因和卫星重复元件。
- 主要证据
- 在人类成纤维细胞中对97个srHC蛋白进行siRNA敲低结合RNA-seq，发现8个蛋白显著激活170–376个srHC基因；ERH敲低导致75%的H3K9me3结构域信号显著下降，并上调154个粟酒裂殖酵母减数分裂基因同源物中的36个；ChIP-seq显示ERH结合于其抑制的srHC基因。
- 研究意义
- 该研究扩展了对脊椎动物中基于H3K9me3的基因抑制复杂性的理解，揭示ERH是哺乳动物H3K9me3调控的关键因子，并提供了一套可通过调控srHC蛋白和基因靶点来增强细胞重编程的资源。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ERH对H3K9me3的全局维持及与SUV39H1的关系验证
验证ERH是否维持H3K9me3异染色质以及其与H3K9甲基转移酶的关系
在成纤维细胞和HepG2细胞中敲低ERH，免疫荧光检测H3K9me3和H3K9me2，Western blot检测HMT总量及超声破碎染色质中的SUV39H1，ChIP-seq检测H3K9me3结构域变化
hiHep重编程联合srHC蛋白敲低的基因激活分析
验证激活型转录因子是否足以表达被异染色质抑制的替代命运基因
在hiHep重编程因子FOXA3、HNF1A、HNF4A存在下，重复97个srHC蛋白的siRNA敲低，RNA-seq分析srHC基因激活，流式检测ASGPR1阳性率评估重编程效率
srHC蛋白聚类及其靶基因异染色质特征分析
根据共同抑制的srHC基因对srHC蛋白进行聚类，并分析各簇靶基因的异染色质亚型
对73个在hiHep重编程中敲低后上调至少93个srHC基因的蛋白进行最近邻聚类，结合已发表的H3K9me3、H3K27me3和srHC-seq数据以及A/B区室、H4K20me1和DNA甲基化数据分析各簇靶基因特征
srHC枢纽蛋白ChIP-seq及ERH位点特异性分析
验证srHC枢纽蛋白是否结合于其功能抑制的基因，并分析ERH敲低对染色质状态的位点特异性影响
对8个srHC枢纽蛋白进行ChIP-seq，分析其在各自敲低上调的srHC基因上的结合；对siControl和siERH进行H3K9me3、H3K27me3 ChIP-seq和srHC-seq，t-SNE分析9275个srHC基因的染色质状态变化
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Eagle最低必需培养基 | Sigma-Aldrich | M2279 |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30071 | |
| L-谷氨酰胺 | GIBCO | 25030149 | |
| Dulbecco改良Eagle培养基 | Hyclone | SH30022.02 | |
| 慢病毒包装 | Fugene6转染试剂 | Promega | E2691 |
| OptiMEM-I减血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| PMD2.G包膜质粒 | Addgene | 12259 | |
| Western blot | RIPA提取缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11873580001 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| NuPAGE LDS上样缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE样本还原剂 | Thermo Fisher Scientific | NP0009 | |
| NuPAGE Novex 4%–12% Bis-Tris蛋白凝胶 | Thermo Fisher Scientific | NP0335 | |
| 抗GAPDH抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365062 | |
| 抗CREM抗体 | ThermoFisher | PA5-81971 | |
| 抗MAZ抗体 | ThermoFisher | PA5-61710 | |
| 抗ETV5抗体 | ThermoFisher | PA5-30023 | |
| 抗NFYB抗体 | ThermoFisher | PA5-31913 | |
| 抗H3K9me3抗体 | Abcam | ab8898 | |
| 抗ERH抗体 | Millipore Sigma | HPA002567 | |
| 抗SUV39H1抗体 | Bethyl | A302-127A | |
| 抗SUV39H2抗体 | Cell Signaling | 8729S | |
| 抗SETDB1抗体 | Cell Signaling | 93212S | |
| HRP标记二抗 | BioRad | 1706515, 1706516 | |
| SuperSignal West Pico化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | 34080 | |
| 免疫荧光 | 96孔玻璃底板 | MatTek | PBK96G-1.5-5-F |
| I型胶原蛋白 | Corning | 354236 | |
| 驴血清 | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 抗H3K9me2抗体 | Active Motif | 39683 | |
| 抗H3K9me2抗体 | Thermo Fisher | 49-1007 | |
| AlexaFluor 488标记二抗 | Thermo Fisher Scientific | A32790 | |
| AlexaFluor 594标记二抗 | Thermo Fisher Scientific | A32754 | |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
| 流式细胞术 | Accutase细胞消化液 | Stem Cell Technologies | 07922 |
| 抗ASGPR1抗体 | BD Biosciences | 563655 | |
| RT-qPCR | ZR-96 Quick-RNA试剂盒 | Zymo Research | R1052 |
| High Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher | 4368814 | |
| Power SYBR Green PCR预混液 | Thermo Fisher | 4367659 | |
| RNA-seq | Superscript II逆转录酶 | Invitrogen | 18064022 |
| KAPA HiFi HotStart预混液 | Roche | 7958927001 | |
| ChIP-seq | Protein G磁珠 | Thermo Fisher | 10004D |
| 抗H3K27me3抗体 | Active Motif | 39155 | |
| 抗HMGA1抗体 | Cell Signaling | 7777S | |
| 抗MYBBP1A抗体 | Millipore Sigma | HPA005466 | |
| 抗ZNF622抗体 | Bethyl | A304-075A | |
| 抗CEBPz抗体 | Bethyl | A303-153A | |
| 抗FUS抗体 | ThermoFisher | PA5-52610 | |
| 抗GATAD2A抗体 | Bethyl | A302-356A | |
| 抗ZNF438抗体 | Millipore Sigma | HPA039843 | |
| 果蝇spike-in染色质 | Active Motif | 53083 | |
| 果蝇H2Av抗体 | Active Motif | 104597 | |
| NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒 | NEB | E7103 | |
| Ampure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| srHC蛋白siRNA敲低筛选 | 两轮siRNA转染间隔时间（三天）、每个靶标两条独立siRNA及两个重复、敲低效率>70%的siRNA选择标准 阅读提示：Methods的siRNA transfection experiments小节及Extended Data Fig. 1a, b |
| RNA-seq差异表达分析 | 以siControl为对照、DESeq2分析、Benjamini多重检验校正Wald检验p≤0.05且log2(foldchange)>0的上调判定阈值 阅读提示：Methods的RNA-seq data analysis小节及Figure 1b图注 |
| hiHep重编程联合敲低 | hiHep慢病毒转导FOXA3、HNF1A、HNF4A，第一轮siRNA在慢病毒处理后一天进行，第14天流式检测ASGPR1阳性率 阅读提示：Methods的hiHep Reprogramming小节及Extended Data Fig. 4h |
| H3K9me3 ChIP-seq | 果蝇染色质spike-in用量（12.5 ng）及H2Av抗体用量（1 μg）、人类染色质用量（3 μg）、抗体用量（2 μg） 阅读提示：Methods的ChIP-seq Chromatin Isolation, Immunoprecipitation, and Library Preparation小节 |
| 免疫荧光H3K9me3定量 | 每个条件成像100–300个细胞、每板包含至少2孔siControl用于归一化、两条独立siRNA各设两个重复 阅读提示：Methods的Immunofluorescence和Imaging and analysis小节及Figure 5b图注 |